龍曉莉，　鄒凡文，　冉茂娟，　龐　科，　劉麗萍（.重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院內(nèi)科，重慶　永川　4060；.湖南省人民醫(yī)院　小兒心臟科，湖南　長沙　4000）

烏司他丁在大鼠慢性阻塞性肺疾病中對肺的保護作用及其機制

龍曉莉1，鄒凡文1，冉茂娟1，龐科1，劉麗萍2
（1.重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院內(nèi)科，重慶永川402160；2.湖南省人民醫(yī)院小兒心臟科，湖南長沙410001）

目的：探究烏司他丁在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺損傷中的保護機制，為治療慢性阻塞性肺疾病用藥提供依據(jù).方法：將大鼠隨機分為正常對照組，模型對照組，烏司他丁實驗組（n＝10）.除正常對照組外，所有大鼠均采用煙熏加氣管滴注脂多糖復合造模的方法建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型.正常對照組和模型常規(guī)治療組均給予正常生理鹽水，實驗組給予烏司他丁.觀察癥狀、體征及肺組織學變化并且測定肺功能.采用酶聯(lián)免疫法檢測血清細胞因子的變化，免疫組織化學法、RT-PCR及western blot分別檢測JAK/STAT通路、MMP-9及基質金屬蛋白酶抑制劑1（MMPs inhibitor1，TIMP1）的表達變化.結果：與正常對照組相比，模型對照組大鼠肺組織受損，肺功能降低.此外，白細胞介素-1β、干擾素γ和IL-6的含量模型對照組高于正常對照組，而IL-4和IL-10模型對照組低于正常對照組.肺組織中JAK1、STAT3、p-STAT3和MMP-9的mRNA和蛋白水平模型對照組高于正常對照組，而TIMP1的mRNA和蛋白水平模型對照組低于正常對照組.治療后，與模型對照組相比，實驗組炎性細胞因子的表達降低，JAK/STAT信號通路、基質金屬蛋白酶的表達降低.與模型對照組相比，實驗組大鼠肺功能較好，JAK1、STAT3和p-STAT3蛋白表達降低，而TIMP1在實驗組的表達升高.結論：烏司他丁可能通過調節(jié)JAK1/STAT3通路與MMP9/TIMP1表達改善慢性阻塞性肺疾病的癥狀.

烏司他??；慢性阻塞性肺疾??；肺損傷；信號通路

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmona-ry disease，COPD）是以不完全可逆的氣流受限為特征的一種慢性疾病狀態(tài)，氣流受限往往呈進行性加重，且主要與肺部對有害顆?；驓怏w的異常炎癥反應有關［1］.在全世界范圍內(nèi)，無論是發(fā)病率還是死亡率仍然在逐年增加［2］.中國在未來的半個世紀將會每年有150萬人死于COPD，預計到2020年，COPD將成為全球第3位死亡原因［3］.吸煙被認為是COPD的最主要危險因素，由于至今仍然沒有明確有效的藥物可以阻止疾病的發(fā)生發(fā)展，戒煙被認為是預防和控制疾病的最主要的方法，然后停止吸煙后，肺部的炎癥反應卻并沒有中止［4－6］.到目前為止，這種異常的炎癥反應在COPD發(fā)生發(fā)展中的機制仍然不是十分清楚.因此，進一步深入COPD中的炎癥反應顯得非常重要［7－11］.

COPD發(fā)病機制復雜，但信號轉導因子（JAK）/轉錄激活因子（STAT）信號轉導通路和蛋白酶/抗蛋白酶系統(tǒng)起著重要的作用.慢性阻塞性肺疾病也與基質金屬蛋白酶（MMPS）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）有關.研究表明JAK和STAT信號通路可以導致大量炎性細胞因子積累，加重炎癥反應.氣道損傷的直接結果是肺組織損傷，引起咳嗽、哮喘和肺功能降低.基質金屬蛋白酶（MMP）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）的表達失衡導致細胞外基質沉積癥退化，導致氣道損傷及肺氣腫［12］.

烏司他丁是近年來研究的高效廣譜蛋白酶抑制劑，已廣泛應用于臨床治療，大量的藥理藥效學研究和臨床研究表明，烏司他丁具有抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、透明質酸酶和纖維蛋白酶的性質，能穩(wěn)定溶酶體酶膜的破裂和減少心肌抑制因子的產(chǎn)生，抑制炎癥介質的過度釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）、內(nèi)皮素等以及清除氧自由基等多種特殊的藥理作用［13－15］.烏司他丁還可以降低毛細血管通透性、改善組織水腫及清除氧自由基等；對肝臟、腎臟、小腸、胰腺、心臟和腦組織等臟器的缺血再灌注損傷具有保護作用；其對COPD急性期患者保護作用主要是通過抑制TNF-α等炎性因子釋放，阻止細胞炎性因子與白細胞間的相互作用，防止白細胞過度激活，減輕白細胞對組織損傷，從而阻止肺損傷發(fā)展，減少炎癥引起肺功能損害［16－18］.本實驗通過探究烏司他丁在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺損傷中的保護機制，為臨床治療慢性阻塞性肺疾病用藥提供科研依據(jù).

1　材料與方法

1.1實驗動物

30只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（180～200克）由廣東省實驗動物中心提供.所有的動物在無特定病原（SPF）條件自由采食和取水.本研究得到中國醫(yī)學倫理委員會批準.

1.2模型建立與分組

采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為3組，每組10只：正常對照組，模型對照組及實驗組.正常對照組大鼠呼吸新鮮空氣.采用宋一平的方法并加以改良建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型如下：在室溫環(huán)境中，第1、14 d大鼠麻醉后氣管內(nèi)滴脂多糖，將大鼠逐一稱質量，按50 mg/kg體質量腹腔注射質量濃度為4 g/L戊巴比妥鈉溶液，待大鼠麻醉后，將其固定于解剖臺上，頭低位暴露聲門，將靜脈套管針沿氣管走行快速插入氣管，拔出針芯，接1mL注射器，1s內(nèi)注入溶于注射用生理鹽水的質量濃度為1 g/L的脂多糖0.2mL（200μg），將大鼠直立，左右旋轉，使脂多糖在肺內(nèi)均勻分布.第2～28 d給予大鼠2次/d香煙煙熏，每次點燃煙絲的質量為9.03g（每支煙煙絲質量為0.645 g），持續(xù)時間大約1 h，間隔4 h（滴脂多糖當天不煙熏）.被動吸煙方法：將大鼠放入自制的有機玻璃染毒箱（100 cm×80 cm×50 cm）內(nèi)，香煙點燃后，用60mL注射器吸滿煙霧，然后通過三通管將香煙煙霧快速注入染毒箱內(nèi)（此操作頻率為20次/min），進行大鼠被動吸煙染毒.為減少香煙燃燒所產(chǎn)的水蒸氣對大鼠的影響，在箱底放置適量硅膠干燥劑.模型對照組：給予吸氧、祛痰、應用抗生素、改善通氣等常規(guī)治療.實驗組：在對照組治療基礎上給予注射用烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字 H19990133，5萬u/支）10萬u＋生理鹽水100mL，靜脈滴注，2次/d，連用7d［19－20］.

1.3觀察記錄指標

記錄大鼠體質量、活動、反應時間、毛發(fā)、糞便、死亡率、呼吸速率、咳嗽、呼吸道分泌物、痰和其他慢性阻塞性肺疾病的癥狀和體征.

1.4肺功能評價

利用小動物肺功能檢測裝置進行檢測，用力肺活量、平均呼氣流量和呼氣峰流速納入記錄.

1.5大鼠肺組織形態(tài)學

48h后用體積分數(shù)為10%甲醛固定，對組織進行常規(guī)沖洗、脫水、石蠟包埋、切成5 μm序列切片，然后將切片脫蠟、脫水、HE染色及光鏡觀察，對支氣管和肺組織形態(tài)學改變進行分析.

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血清干擾素-γ、白細胞介素-4（IL-4）、IL-6和白細胞介素-10（IL-10）.操作嚴格按照試劑盒說明進行.

1.7免疫組織化學檢測

肺組織免疫組織化學檢測MMP-9，TIMP-1，JAK1和STAT3.操作嚴格按照免疫組化步驟進行.

1.8qRT-PCR檢測

實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測肺組織基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）、JAK1和STAT3 mRNA.選用β-actin作為內(nèi)參基因.使用 Transgen Biotech公司qPCR and qRT-PCR SuperMix，Bio-Rad公司CFX，每組3個復孔，反應條件為：94℃30 s，94℃5 s，55℃15 s，72℃10 s，共45個循環(huán).由儀器配套專用軟件進行結果分析，通過與內(nèi)參對比檢測各組組織中MMP-9，TIMP1，JAK1，STAT3 mRNA的表達情況.β-actin上游引物：CGTTGACATCCGTAAAGACC；下游引物：GCTAGGAGCCAGGGCAGTA.MMP-9上游引物：GATCCCCAGAGCGTTACTCG；下游引物：GTTGTG-GAAACTCACACGCC.TIMP1上游引物：ACGCTAG-AGCAGATACCACG；下游引物：GCCCTTATAACCAG-GTCCGAG.JAK1上游引物：ATGGAGTTTCTGCCT-TCGGG；下游引物：CTCCGGAGCGTACCAAAACA.STAT3上游引物：AAAGTATTGTCGCCCCGAGA；下游引物：CAGGTCGTTGGTGTCACACAG.引物由上海生工所設計合成.

1.9Western blot檢測

Western blot檢測肺組織中JAK1/STAT3信號通路、MMP-9和TIMP1蛋白的表達.將肺組織用Ly-sis Buffer（北京碧云天生物科技有限公司）裂解后檢測蛋白表達.β-actin及辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（抗兔、抗鼠）均購自美國Santa Cruz公司；JAK1/STAT信號通路、MMP-9和TIMP1D蛋白抗體購自Cell Signaling公司.

1.10統(tǒng)計學分析

應用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均值和標準差（珋x±s）表示，對所有樣本進行正態(tài)檢驗，采用方差分析法進行組間比較.P＜0.05為差異有顯著性.

2　結果

2.1生物學觀測

對照組中，食物的攝入量和體質量逐漸增加.大鼠呼吸頻率穩(wěn)定，無呼吸道分泌物，無痰.實驗組大鼠食欲減退，毛發(fā)脫落，體質量低于對照組（P＜0.05）.實驗組大鼠呼吸急促，呼吸頻率（2.12± 0.69）顯著高于對照組（1.42±0.39）.此外，實驗組鼻腔和口中有分泌物，有咳嗽，呼吸道有痰液，表明該組肺功能減低.烏司他丁治療組癥狀明顯好于模型對照組，體質量和呼吸頻率優(yōu)于模型對照組，（P ＜0.05），見表1.

表1　各組間大鼠體重和呼吸頻率的比較Table 1　Comparison of body weight and respiratory fre-quency in rats?。╪＝10±s）

表1　各組間大鼠體重和呼吸頻率的比較Table 1　Comparison of body weight and respiratory fre-quency in rats　（n＝10±s）

1）P＜0.05

分組　體質量/（g）　呼吸頻率/（Hz）正常對照組210g±16.6　1.4±0.4模型對照組　197±15.3　2.1±0.31）烏司他丁實驗組　206±14.7　1.7±0.31）

2.2肺功能的改變

與對照組相比，肺功能指標如用力呼氣流量（FEV）、用力肺活量（FVC）模型對照組明顯降低（P＜0.05）.實驗組FEV、FVC明顯優(yōu)于模型對照組，（P＜0.05），見表2.

表2　各組間大鼠肺功能參數(shù)的比較Table 2　Comparison of lung function parameters in rats?。╪＝10，珋x±s）

2.3肺組織形態(tài)學變化

對照組氣管柱狀上皮細胞，纖毛排列整齊，氣管和支氣管杯狀細胞為主，沒有腺體增生及炎癥細胞浸潤.模型對照組中，氣管上皮脫落，杯狀細胞和腺體肥大，炎性細胞浸潤.此外，支氣管粘膜皺襞改變，中性粒細胞出現(xiàn)，呼吸性細支氣管和肺泡管有囊性擴張，泡壁變薄，有小葉中央型肺氣腫.烏司他丁實驗組，炎性細胞浸潤少見，肺泡間隔破壞也相對較少，氣管粘膜纖毛受損減少，柱狀上皮細胞完整，見圖1.

圖1　肺組織形態(tài)學變化（HE，×200）A：Normal control group；B：postive control group；C：Ulinastatin groupFig.1　The morphological changes in lung tissue（HE，×200）

2.4血清細胞因子的變化

與正常對照組相比，模型對照組IL-4、IL-10表達降低，而IFN-γ和IL-6的表達明顯升高.與模型對照組相比，實驗組IL-4和IL-10的表達明顯升高，而IFN-γ和IL-6的表達降低，見圖2.

圖2　大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10的表達Fig.2　Expression of serum IFN-γ，IL-4，IL-6，and IL-10 in rats

2.5肺組織中MMP-9、TIMP-1、JAK1和STAT3的光密度值

與正常對照組相比，模型對照組肺組織中MMP-9、JAK1和STAT3的光密度值均較高，而TIMP1的光密度值較低.與模型對照組相比，實驗組MMP-9、JAK1和STAT3的光密度值均較低，而TIMP的光密度值較高.

肺組織的JAK1/STAT3信號通路、MIMP-9、TIMP1基因和蛋白在肺組織的表達

RT-PCR和Western blot結果顯示，與對照組相比，模型對照組JAK1、STAT3，肺組織中MMP-9mRNA表達升高（P＜0.05），MMP-9、JAK1、p-JAK1、STAT3和p-STAT3蛋白均表達升高，而TIMP1 mRNA和蛋白表達均降低.（P＜0.05）.與模型對照組相比，實驗組JAK1、MMP-9 mRNA的表達和JAK1、p-JAK1、MMP-9和p-STAT3蛋白的表達均較低，但TIMP1 mRNA和蛋白表達均較高，見圖3、4及表3、4.

圖3　各組JAK1和STAT3信號通路、MMP-9、TIMP1 mRNA水平的表達1：Normal control group；2：postive control group；3：Ulinastatin groupFig.3　Expression of JAK1/STAT3 signaling pathway，and MMP-9，TIMP1 mRNA in each group

圖4　各組JAK1/STAT3信號通路、MMP-9、TIMP1蛋白水平的表達1：Normal control group；2：postive control group；3：Ulinastatin groupFig.4　Expression of JAK1/STAT3 signaling pathway，and MMP-9，TIMP1 protein in each group

表3　肺組織MMP-9、TIMP1、JAK1和STAT3 mRNA水平的比較Table 3　Comparison of MMP-9，TIMP1，JAK1，and STAT3 mRNA in lung tissue（珋x±s）/（ng·μL－1）

表4　各組間肺組織　MMP-9、TIMP1、JAK1和STAT3蛋白水平的差異性Table 4　Comparison of MMP-9，TIMP1，JAK1，and STAT3 protein in lung tissue （珋x±s）/（ng·μL－1）

2.6相關性分析

JAK1 mRNA、STAT3蛋白與IL-6正相關.MMP-9 mRNA與FEV和IL-10負相關.p-STAT3蛋白與IFN-γ正相關.TIMP1蛋白和PEF正相關.STAT3蛋白與FEV呈負相關.MMP-9蛋白與PEF顯著負相關（P＜0.05）.JAK1、STAT3和p-STAT3與MMP-9呈正相關.STAT3和p-JAK1正相關，MMP-9和TIMP-1負相關，見表5、6.

表5　JAK1/STAT3信號通路、MMP-9和 TIMP1在 COPD模型中的關聯(lián)性分析Table 5　Relationships between the JAK1/STAT3 pathway，MMP-9，and TIMP1 in COPD

表6　JAK1/STAT3信號通路與 MMP-9、TIMP蛋白相關性分析Table 6　Correlation between JAK1/STAT3 pathway and MMP-9，TIMP1 protein

3　討論

慢性阻塞性肺疾病呈進行性發(fā)展，細胞因子趨化炎癥細胞導致肺組織遷移活化，釋放各種酶及氧化產(chǎn)物，促使肺功能逐步惡化.烏司他丁是近年來研究的高效廣譜蛋白酶抑制劑，已廣泛應用于臨床治療.烏司他丁還可以降低毛細血管通透性、改善組織水腫及清除氧自由基等；對肝臟、腎臟、小腸、胰腺、心臟和腦組織等臟器的缺血再灌注損傷具有保護作用；其對COPD急性期患者保護作用主要是通過抑制TNF-α等炎性因子釋放，阻止細胞炎性因子與白細胞間的相互作用，防止白細胞過度激活，減輕白細胞對組織損傷，從而組織肺損傷發(fā)展，減少炎癥引起肺功能損害［11］.

本研究建立氣管滴入脂多糖COPD大鼠模型，該模型可以模擬氣道炎癥細胞浸潤導致氣道粘液高分泌的COPD臨床病理學.該模型還通過被動吸煙導致氣道重塑、肺氣腫和其他結果的改變.結果表明，呼吸急促和呼吸頻率加快明顯加劇了呼吸道分泌物的流出，模型中還表現(xiàn)為咳嗽和呼吸道痰液流出.因此，該模型復合慢性阻塞性肺疾病的臨床病理學特點［5，9－10］.

大鼠慢性阻塞性肺疾病模型可見氣道炎癥細胞浸潤、肺組織病理改變，肺功能下降.脂多糖可以直接或間接刺激巨噬細胞和中性粒細胞，從而誘導JAK1在JAK1/STAT3信號通路中JAK1磷酸化.JAK1活化能迅速激活STAT3磷酸化.該信號通路的激活參與細胞增殖、分化和凋亡.IL-6是一種在慢性阻塞性肺疾病肺上皮細胞和內(nèi)皮細胞上調節(jié)JAK1/STAT3重要調節(jié)因子.IL-6可直接激活STAT3，并伴有STAT3的活化［12］.

研究表明，在COPD患者這MMP-9表達升高，而TIMP-1表達降低.本組發(fā)現(xiàn)，MMP-9與炎性細胞因子呈正相關.進一步相關性分析表明，JAK1、STAT3、MMP-9與p-STAT3呈正相關，STAT3和p-JAK1正相關，MMP-9和TIMP1負相關.與正常對照組相比，模型對照組MMP-9和MMP-9/TIMP-1表達升高，提示有COPD氣道炎癥.JAK1/STAT3信號通路的過度激活能降低TIMP-1的表達，從而不能抑制MMP-9的表達.MMP-9的過表達導致細胞外機制作用增強，增加氣道炎癥反應.研究表明，MMP/JAK/STAT3信號軸環(huán)氧化酶-2（COX-2）的過表達，導致氣道和肺組織的損傷.

綜上所述，烏司他丁能改善COPD癥狀，可能機制是對JAK/STAT3調節(jié)信號轉導、MMP-9/TIMP-1和抑制炎癥反應相關.

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［責任編輯：陳詠梅］

Lung protective effects and mechanism of ulinastatin on chronic obstructive pulmonary disease of rats

LONG Xiaoli1，ZOU Fanwen1，RAN Maojuan1，PANG Ke1，LIU Liping2
（1.Department of Internal Medicine，Yongchuan Hospital，Chongqing Medical University，Yongchuan，Chongqing 402160，China；2.Department of Pediatric Cardiology，Hunan People′s Hospital，Changsha 410001，China）

Aim：To observe effect of ulinastatin on the janus kinase（JAK）/signal transducer and ac-tivator of transcription（STAT）pathway and matrix metallo-proteinases（MMPs）in chronic obstructive pulmonary disease（COPD）rat model.Methods：Rats were randomly divided into a normal group，mod-el group，ulinastatin group（n＝10）.Aside from the normal group，all rats were exposed to smoke plus lipopolysaccharide tracheal instillation to establish the COPD model.Changes in symptoms，signs，and lung histology were observed.Lung function was measured with a spirometer.Serum cytokines were de-tected using enzyme-linked immunosorbent assay，and changes in the JAK/STAT pathway，MMP-9，andMMPs inhibitor 1（TIMP1）were detected by immunohistochemistry，RT-PCR，and western blotting，re-spectively.Results：Compared with the normal group，lung tissue was damaged，and lung function was reduced in the model control group.Additionally，the levels of interleukin（IL）-1β，γ interferon（IFN-γ），and IL-6 were higher，while IL-4 and IL-10 were lower in the model control group than those in the normal group.The expressions of JAK1，STAT3，p-STAT3，and MMP-9 mRNA and protein in lung tis-sue were higher，and TIMP1 mRNA and protein was lower in the model group compared with the normal group.After treatment，compared with the model group，the expression of inflammatory cytokines was lower in each treatment group，and expressions of JAK/STAT pathway，MMPs were lower.Conclusion：ulinastatin can improve the symptoms of COPD possibly by regulating the expression of the JAK1/STAT3 pathway and MMP9/TIMP1.

Ulinastatin；chronic obstructive pulmonary disease；lung injury；signal pathway

R446.9

A

1000－9965（2015）06－0496－07

10.11778/j.jdxb.2015.06.010

2015－10－10

國家自然科學基金項目（30971105）

龍曉莉（1979－），女，醫(yī)師，研究方向：全科醫(yī)學

鄒凡文，女，主任醫(yī)師，Mobile：13368120166；E-mail：2968182323＠qq.com