夏楓峰，晁　敏，沈新強，王云龍

（1.舟山市水產技術推廣站，浙江舟山　316000；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，上?！?00090）

·研究簡報·

制漿造紙廢水曝露對藻類的毒性效應

夏楓峰1，晁敏2，沈新強2，王云龍2

（1.舟山市水產技術推廣站，浙江舟山316000；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海200090）

以AOX含量為17.87 mg/L，CODCr含量為707.0 mg/L的化學制漿造紙漂白廢水為實驗液，開展其對三角褐指藻和扁藻的96 h毒性效應實驗。結果表明：實驗用造紙廢水對三角褐指藻和扁藻的96 h-EC50AOX濃度介于2.91～2.87 mg/ L，CODCr濃度介于176.3～138.7 mg/L。與同等稀釋條件下魚類、蝦蟹類和貝類的實驗相比，藻類的敏感性較高。

毒性效應；AOX；生長抑制率

沿海地區(qū)的工業(yè)廢水通常選擇海洋處置方法，廢水出排放擴散器后在海流作用下快速得到稀釋擴散，然而含有持久性有機污染物的工業(yè)廢水如造紙廢水等進行海洋處置需慎重考慮其對海洋生態(tài)系統(tǒng)可能的風險影響，如經氯漂白的造紙廢水中可能含有200多種有機氯化物，其中毒性最強的是被國際癌癥研究機構（IARC）列為I類人體致癌物的2，3，7，8-TCDD（二惡英的一種），這些難以降解的污染物可以通過食物鏈的累積作用進而影響到人類健康［1-3］。為限定廢水中有機氯化物總量，國際上通常以AOX（Absorbable organic halogens，可吸附有機鹵化物）作為替代具體有機氯化物的控制指標。盡管我國《造紙工業(yè)水污染物排放標準》（GB3544-2008）中也把AOX列為強制監(jiān)測項目，針對不同企業(yè)排放標準作出了不同規(guī)定，但受到漂白工藝、造紙原料、溫度等多種因素的影響，產生的廢水中有機氯化物的種類、含量有所不同，僅通過AOX值的大小難以反映出其毒性強弱和對生態(tài)環(huán)境的影響。

近年來，生物監(jiān)測在水體污染調查研究中得到了廣泛應用［4-5］。生物監(jiān)測基本原理就是將生物體暴露于污染物中，通過對實驗組與空白對照組進行對比分析來評價污染物毒性的一種方法［6］。由于對污染物進行單純的理化分析難以有效評價其潛在危害，而暴露于污染水體中的生物能夠在生長過程中將污染物的影響反映出來，進而對多種混合有毒物質的毒性作出直觀、合理的評估［7-9］。鑒于不同生物對污染物的敏感程度不同，國內外學者開展了造紙廢水對多種生物的毒性效應研究，受試生物涉及生態(tài)系統(tǒng)的各個層次，如細菌、貝類、蝦蟹類、魚類等［10-12］。藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)的初級生產者，具有個體小、繁殖快、對毒物敏感等特點［7］。本文選擇三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum和扁藻Platymonas sp.兩種藻類來研究不同稀釋濃度下造紙廢水的毒性效應，對研究造紙廢水的最大安全稀釋度具有重要意義。

1　材料與方法

1.1藻類培養(yǎng)

三角褐指藻和扁藻的采用海水鹽度為20的f/2藻類生長培養(yǎng)基［13］培養(yǎng)。取處于指數(shù)生長期的藻液10 mL，接種于150 mL經滅菌處理的三角燒瓶中，加培養(yǎng)液至總體積為50 mL，置于光照培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)，光、暗周期比設為12:12，為使藻類在最適溫度條件下生長，三角褐指藻培養(yǎng)溫度為16℃，扁藻為28℃［14］。

1.2造紙廢水對藻類毒性試驗

實驗用造紙廢水取自某紙業(yè)公司的化學制漿造紙漂白廢水，廢水經初級沉淀、過50 μm醋酸纖維素濾膜，作為實驗原液。

毒性試驗設9個實驗組，每組設2個平行樣，各組試驗液總量100 mL，含藻液20 mL，其余為造紙廢水和過濾海水按比例配比，其中，造紙廢水在各組的比例分別為80%、50%、22.2%、10%、5%、3.3%、1%、0.33%、0%，0%作為對照組。

毒性試驗共進行96 h，試驗開始后，分別于0、24、48、72和96 h取1 mL樣品，用顆粒計數(shù)儀Multisizer 3（COULTER Counter）測試藻類數(shù)量。

實驗液的CODCr采用重鉻酸鹽法測定，AOX采用有機鹵素（AOX）分析儀MULTI X2000（德國）測定，測定原理同庫侖法。

1.3數(shù)據處理

各時刻顆粒計數(shù)儀計數(shù)數(shù)據轉化為藻細胞密度。以0 h的密度為基準值，將0、24、48、72和96 h數(shù)據標準化，0 h的標準化值為1。

以藻類生長抑制率作為評價造紙廢水對藻類生長毒性效應的指示指標，公式如下：

其中：Em為1:n稀釋比濃度某時刻的生長抑制率（可取24、48、72和96 h）；Ntn為1:n稀釋比濃度某時刻的標準化值（可取24、48、72和96 h）；Ncn為對照組某時刻的標準化值（可取24、48、72和96 h）。

藻類生長受影響廢水濃度（Effective Concentration，EC）計算方法為：把造紙廢水稀釋濃度比轉化為稀釋百分比C，Ln（C）與某時刻藻類生長抑制率作線性回歸分析，利用SPSS軟件預測得藻類不同比率條件下的EC值（如EC10、EC25、EC50、EC75等），同時可計算出EC的95%置信區(qū)間。

2　結果與分析

2.1廢水主要理化指標

廢水中主要污染物含量以CODCr和AOX表示，表1列出了原液及不同稀釋比條件下的CODCr和AOX值，其中原液中AOX含量為17.87 mg/L，CODCr為707 mg/L，懸浮物含量為37 mg/L，略高于現(xiàn)行《造紙工業(yè)污染物排放標準》（GB3544-2008）對AOX規(guī)定排放最大限值（15 mg/L）。

表1　不同稀釋比下實驗液的CODCr和AOX含量（mg/L）Tab.1　Concentrations of CODCrand AOX in the dilution gradient solutions from pulp mill effluent

2.2造紙廢水曝露條件下的藻類生長曲線

2.2.1三角褐指藻

三角褐指藻96 h生長曲線如圖1所示，當廢水按80%、50%、22.2%稀釋時，第24小時藻細胞負增長，細胞的增殖受到造紙廢水抑制，從第48小時開始，22.2%組藻細胞密度有所增加，而80%、50%兩組藻細胞密度沒有繼續(xù)增加。在第24小時，10%～0.33%組及對照組的藻細胞密度均沒有明顯增長，從第48hr開始各組細胞開始增殖，對照組生長速率一直最高，10%組一直最低。

圖1　三角褐指藻在不同稀釋濃度實驗條件下的96 h生長曲線Fig.1　Growth curves of Phaeodactylum tricornutum in the dilution gradient solutions from pulp mill effluent

圖2　扁藻在不同稀釋濃度實驗條件下的96 h生長曲線Fig.2　Growth curves of Platymonas sp.in the dilution gradient solutions from pulp mill effluent

2.2.2扁藻

扁藻96 h生長曲線如圖2所示，第24小時所有組包括對照組生長速率均很低，從第48小時開始各組細胞開始增殖，對照組生長速率一直最高，80%組一直最低。

2.2.3不同時刻藻類密度標準化值分布曲線

（1）三角褐指藻：從圖3三角褐指藻密度標準化曲線直觀判斷，5%濃度及低濃度在24、48、72 h標準化密度基本接近，將三角褐指藻5%～0.33%濃度范圍第24、48、72和96小時藻類生長速率分別與對照組生長速率作t檢驗，結果表明，24、48和72 h三角褐指藻生長速率與對照組無顯著差異（p值分別為0.09、0.31、0.26），而96hr具有顯著差異（p值為0.02）。以上結果表明低濃度廢水曝露（5%～0.33%）對藻類生長的抑制主要發(fā)生在第4天。

（2）扁藻：把扁藻5%～0.33%濃度范圍24、48、72和96 h生長速率分別與對照組生長速率作t檢驗，結果表明第24和48小時三角褐指藻生長速率與對照組無顯著差異（p值分別為0.757、0.24），而72和96 h具有顯著差異（p值分別為0.009和0.022）。以上結果表明低濃度廢水曝露（5%～0.33%）對扁藻生長的抑制主要發(fā)生在第3天以后。

圖3　三角褐指藻和扁藻24、48、72和96 h密度標準化值分布曲線Fig.3　Distribution curves of density standardization for Phaeodactylum tricornutum and Platymonas sp.in the dilution gradient solutions from pulp mill effluent in different time

2.3造紙廢水曝露對藻類生長影響濃度

造紙廢水稀釋濃度取對數(shù)，與三角褐指藻、扁藻的96 h生長抑制率分別作線性回歸分析，得線性方程為：

三角褐指藻：Ln（C）=6.111×抑制率%-6.328 1（R2=0.92）

扁藻：Ln（C）=7.932 3×抑制率%-7.118 3（R2=0.95）

經顯著性檢驗，結果分別為F（1，7）=79.458，p=0.000 01＜＜0.000 1；F（1，7）=130.108，p=0.000 06＜＜0.000 1，表明兩種受試藻類的Ln（C）與抑制率之間均存在極顯著線性相關關系。

利用SPSS軟件預測兩種受試藻類不同生長抑制率的曝露濃度及95%置信區(qū)間（表2），其中96 h-EC50值分別為3.79%、4.28%（體積百分比），95%置信區(qū)間分別為2.20%～6.52%、2.78%～6.57%。

表2　三角褐指藻50%生長抑制率時的稀釋濃度及其95%置信區(qū)間Tab.2　Dilution volume fractions for Phaeodactylum tricornutum in growth inhibitions 50%

3　討論與結論

藻類是海洋中初級生產力提供者，造紙廢水入海后對浮游植物生長抑制程度成為影響受納海域生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要因素。研究證明，藻類比魚類、無脊椎動物對造紙廢水中有機氯化物更敏感，如在波羅地海水域，廢水中含有50 mg/L的氯酸鹽就可使12 km2海域范圍的大型褐藻消失，取而代之的是藍綠藻和紅藻，初級生產力和浮游動物區(qū)系也相應受到長久性影響［15］。KALLQVIST等［16］的研究表明，當廢水中AOX含量為3.6 kg/t（16.4 mg/L）時對中肋骨條藻的EC50為2.4%～2.9%。

實驗用造紙廢水對三角褐指藻和扁藻的96 h-EC50稀釋濃度比分別為3.79%和4.28%，其AOX含量介于2.91～2.87 mg/L，CODCr含量介于176.3～138.7 mg/L。同等稀釋條件下，該造紙廢水對斑馬魚Brachydanio rerio、對脊尾白蝦Exopalaemon carinicauda、中華絨螯蟹Eriocheir sinensis大眼幼體和縊蟶Sinonovacula constricta 96 h-LC50（半致死濃度）稀釋濃度比分別為7.14%、14.3%、44.4%和62.9%［11］。造紙廢水對藻類、魚類、蝦類、蟹類、貝類的毒性效應依次降低，藻類的敏感性高于魚類、蝦蟹類和貝類，這與BAILEY等［17］研究的造紙廢水對不同種類淡水水生生物敏感性結論相一致。

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Exposure Effect of Pulp Mill Effluent on the Growth of Algae

XIA Feng-feng1，CHAO Min2，SHEN Xin-qiang2，et al
（1.Fisheries Technology Extending Stations of Zhoushan City，Zhanshan316000；2.East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai200090，China）

The 96 hr algae growth inhibition tests of Phaeodactylum tricornutum and Platymonas sp.were conducted on dilution gradient solutions from pulp mill effluent，which contained 17.87 mg/L AOX，707.0 mg/L CODCr.It showed that the algal 96 h-EC50varied from 2.87 to 2.91 mg/L for AOX，and from 138.7-176.3 mg/L for CODCr.Algae exhibited the greatest sensitivity compared with fish，shrimp，crab and shellfish on the same diluted series test.

toxic effect；AOX；growth inhibition

X503.225

A

1008-830X（2015）02-0192-04

2014-12-10

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2010CB429005）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金資助項目（中國水產科學研究院東海水產研究所）（2007M02）

夏楓峰，女，浙江舟山人，研究方向：養(yǎng)殖生態(tài).