徐 翔， 汪海濱， 孫中生， 周紹龍， 曾 立， 羅盛康

脂肪移植與研究

脂肪來源SVF聯(lián)合PRP注射改善鼻唇溝的臨床研究

徐 翔， 汪海濱， 孫中生， 周紹龍， 曾 立， 羅盛康

目的 觀察并分析富含血小板血漿(PRP)聯(lián)合血管基質片段(SVF)治療面部鼻唇溝的有效性及安全性。 方法 對30 例鼻唇溝明顯的患者，從外周靜脈獲取血液，通過離心法獲得PRP；在患者大腿外側抽取脂肪，并通過酶解法獲取脂肪組織的SVF。按一定比例混合后，注射在鼻唇溝的真皮深層及皮下組織層。治療醫(yī)師依據(jù)皺紋評估分級(WAS)，對鼻唇溝進行評估，評估時間點為術前,術后即刻、7 d、1個月、3個月、6個月。結果 所有患者的鼻唇溝都得到了較大程度的改善，注射過程中及術后未出現(xiàn)動靜脈栓塞、注射區(qū)皮膚及組織壞死、感染、纖維化、組織變硬及形成腫塊等并發(fā)癥。術前WAS評分為3.30 ± 0.47，術后即刻、7 d、1個月、3個月、6個月分別為1.22±0.54、0.69±0.45、0.98±0.55、1.18±0.64、1.23±0.72。其中，術后7 d的WAS評分下降程度最低，術后觀察點WAS評分與術前相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。 結論PRP聯(lián)合SVF療法，在不采用外源性填充材料的情況下，可以顯著改善中老年患者的鼻唇溝凹陷，有非常好的應用前景。

血管基質片段； 富血小板血漿； 鼻唇溝； 面部年輕化

自體脂肪移植由于取材豐富、操作簡單等優(yōu)點，成為自身軟組織缺損填充的研究熱點。有文獻證實，血管基質片段(stromal vascular faction， SVF)中富含的脂肪間充質干細胞在脂肪移植后的恢復過程中發(fā)揮著更為重要的作用[1-2]。此外，還有大量文獻證實，從人體血液中獲取的富血小板血漿(platelet rich plasma， PRP)，通過注射法植入體內后,可以大量釋放細胞因子，如：PDGF、VEGF、TGF等，能夠刺激成纖維細胞的增殖及膠原成分的沉積[3-5]。因此，自2013年3月至2014年6月，我們基于細胞療法與細胞因子療法相結合對改善組織容量的考慮，將PRP與SVF混合后,注射于鼻唇溝真皮深層及皮下組織層，臨床效果滿意?，F(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

本組共30例患者。男性8例，女性22例；年齡30～57歲，平均44歲。均為WAS評分[6]為3.0～4.0分的中、重度鼻唇溝患者，近6個月內未進行任何鼻唇溝部位的處理和治療。局部無皮損或其他皮膚疾??；肝腎功能正常；無嚴重過敏反應病史和出血性疾病史。女性患者未處于妊娠或哺乳期。

2 方法

2.1 PRP的制備 用21 G蝶形采血針經外周靜脈獲取血液9.0 ml，與1.5 ml抗凝枸櫞酸鹽溶液混合。采集血液在室溫下經160 g離心10 min，離心后的血液分為3層，最上層為淡黃色血漿，最下層為紅細胞層，血小板主要聚集在上下兩層的交界區(qū),即中間層。將上清液和中間層轉移到另一試管內進行第2次離心，室溫下400 g離心10 min。離心完成后，上層不含血小板血漿，下層即PRP(血小板濃度>1×106/μl)。在整個操作過程中，血小板未被激活。

2.2 SVF的制備 采用腫脹抽脂技術，于大腿外側獲取10 ml純化脂肪，采用0.25%Ⅰ型膠原酶等量混合后，37 ℃消化30 min，期間每隔10 min進行震蕩混勻處理，以使膠原酶和脂肪組織能夠充分接觸。消化完成后，采用200目過濾網過濾，過濾后，混懸液經1200 g離心5 min，倒棄離心管上層液體，緊貼管壁下端液體,即為SVF細胞群。

2.3 注射方法 將獲得的2 ml PRP與SVF細胞群沉淀混合，分別用2支1 ml注射器進行分裝。用1%利多卡因行雙側眶下神經阻滯麻醉，采用27 G針頭按照線性注射方法，分別注入鼻唇溝真皮深層及皮下組織，針頭與皮膚表面成20°～30°。由鼻唇溝下方至上方，深層至淺層，呈厥葉狀注射(圖1)，直至鼻唇溝完全矯正，注射完成后給予局部冰敷20 min。注射過程無需矯枉過正，每側注射量均小于1 ml。

2.4 療效評價 治療醫(yī)師分別在術前，術后即刻、7 d、1個月、3個月、6個月，依據(jù)WAS 對鼻唇溝進行評估。

3 結果

本組共30例患者每側注射量為0.5～1.0ml,平均0.8ml。術后隨訪 6～9個月。注射完成后，鼻唇溝皺紋幾乎完全矯正，術后6個月效果仍然維持(圖2)；注射過程中未出現(xiàn)明顯的出血或血管栓塞等并發(fā)癥，1周內治療區(qū)域輕微淤青完全消失，術后隨訪時未發(fā)現(xiàn)明顯的結節(jié)和其他不良反應；術前WAS評分為3.30±0.47，術后即刻、7d、1個月、3個月、6個月分別為1.22±0.54、0.69±0.45、0.98±0.55、1.18±0.64、1.23±0.72。其中,術后7dWAS評分下降程度最低，術后觀察點WAS評分與術前相比,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

4 討論

面部皮膚皺紋根據(jù)其分布位置可以分為額紋、眉間紋、魚尾紋、法令紋及木偶紋等。根據(jù)其發(fā)生機制可以分為動態(tài)性皺紋及靜態(tài)性皺紋。動態(tài)性皺紋的形成,主要是由于面部表情肌的過度活動而在皮膚表面留下痕跡[7]，針對這類皺紋的處理，臨床上主要采用肉毒毒素進行局部注射治療[8-9]。肉毒毒素是通過抑制神經末梢內部乙酰膽堿的釋放而達到廢用性肌肉萎縮，從而改善面部皺紋。靜態(tài)性皺紋的產生機制主要有以下3種[10]：⑴由于動態(tài)性皺紋的長期存在，引起膠原纖維的斷裂，從而導致皮膚表皮層及真皮層形成折痕；⑵隨著年齡的增長，組織容量不斷丟失，局部組織容量的不足使得皺紋更為明顯[11]； ⑶由于長期的重力作用，使面部軟組織整體下移。

圖1 鼻唇溝注射填充方法示意

Fig 1 Methods of injecting filling of nasolabial fold.

圖2 脂肪來源SVF聯(lián)合PRP注射改善鼻唇溝前后對比 a.術前 b.術后即刻 c.術后6個月

Fig 2 Comparison between preview and postview of nasolabial fold augmentation using a combined injection of platelet rich plasma and adipose-derived stromal vascular fraction. a.preview. b. postview at once. c.postview at 6 months.

中老年人群的鼻唇溝通常是由于局部組織容量的不足而導致面部外觀整體老態(tài)化。其治療以注射填充恢復容量為主，主要治療方法為注射可吸收真皮組織填充物。然而，所伴隨的缺點包括改善效果短暫、填充物的再吸收；另外，如果注射永久性填充材料，還伴有異體反應，如包膜、肉芽腫形成，慢性或遲發(fā)型感染[12-13]。此外， 還有一些軟組織填充材料依賴于自身組織的纖維化反應，達到容量擴增的效果，這部分材料也主要是人工合成的非生物材料。相比較而言,由自身所獲得的軟組織填充物則是一個較為合適的選擇。

Azzena等[14]報道曾應用自體脂肪結合PRP的方法治療凹陷性瘢痕；O′Connell等[15]還報道了65%的下肢靜脈潰瘍用PRP治療后，在16周內可完全愈合。通過適當?shù)姆椒ㄟM行低速離心產生富含血小板的血漿，富集后血漿中血小板濃度是全血中血小板濃度的60倍。這些血小板被證實其具有較高的生物活性，并且能在體外7 d內持續(xù)釋放PDGF-BB、VEGF-A、TGF-b和IGF-1，這些細胞因子可以促進內皮細胞等的增殖。因此，我們認為，在真皮內或者真皮下層注射高濃度的血小板及生長因子，可以產生更多的自體膠原，從而增加局部組織容量。

Kakudo等[16]將脂肪來源干細胞及真皮成纖維細胞與PRP或不含血小板血漿(platelet-poor plasma, PPP)混合,結果發(fā)現(xiàn)，與PRP相混合的脂肪來源干細胞比與PPP相混合的干細胞，其增殖活性明顯增加；而人真皮成纖維細胞的增殖活性也明顯增強；同時還發(fā)現(xiàn)，當與5%的PRP混合后，人真皮成纖維細胞和脂肪來源干細胞在第7天的增殖活性達到最高。當與更高或者更低濃度的PRP相混合時，效果則不明顯。 Choi等[17]發(fā)現(xiàn)，牙槽骨細胞在低濃度的PRP作用下增殖，但是在高濃度的PRP環(huán)境中，其增殖受到抑制。由此可知，為了達到最好的效果，生長因子的最佳濃度也是非常重要的，并不是我們傳統(tǒng)所認為的越高越好。

血小板內的α顆粒包含許多細胞生長因子，這些生長因子在凝血酶或鈣離子的作用下，可被激活[18]。激活后，短時間內將釋放大量的生長因子，但這一過程是非持續(xù)性的。一些早期研究證實了與這一過程相關的組織學和臨床效應，然而，這些效應只發(fā)生在早期并且是短暫的。因此，這一過程的缺陷是缺乏更為持續(xù)的作用效果。有趣的是，Scherer等[19]發(fā)現(xiàn)，與凝血酶激活后的血小板相比較，未激活的血小板在促進創(chuàng)面愈合方面更具優(yōu)勢，因而傾向于將未激活的血小板用于細胞療法，而不是單純的存儲細胞因子。他們認為，在未激活的狀態(tài)下，血小板能夠保持良好的功能活性，并持續(xù)緩慢的釋放細胞因子。因此，本研究中所使用的PRP提取物中，未添加氯化鈣或者凝血酶等血小板激活物。

在PRP輔助創(chuàng)面愈合或者組織容量的補充過程中，在具備細胞因子的情況下，還需要其他細胞成分的參與，尤其是具備分化潛能的間充質干細胞的參與，這些細胞成分能在相關細胞因子的作用下進行增殖、分化。對這部分細胞成分進行適當?shù)难a充，能夠更好地促進我們的治療效果。SVF作為脂肪組織來源的混雜細胞群，包含富含CD34的間充質干細胞，具備來源豐富，獲取簡單等優(yōu)點[20]。因此，選擇SVF細胞群輔助鼻唇溝的軟組織擴增，是十分有意義的。同時，本研究也是首次將PRP和SVF聯(lián)合治療鼻唇溝。

PRP聯(lián)合SVF療法的優(yōu)勢在于，在含有高濃度且可釋放細胞因子的血小板的同時，又含有高濃度具備分化潛能的間充質干細胞。相關研究證實，在真皮或真皮下注射生長因子時，可刺激成纖維細胞的膠原沉積。本研究結果顯示，術后7 d鼻唇溝的改善效果最佳，這可能與局部腫脹有關；7 d后改善效果開始減退；在術后1～6個月期間維持穩(wěn)定，但效果還是明顯優(yōu)于治療前。7 d后的表現(xiàn)可能是由于注射混合物的血清成分開始被吸收以及腫脹情況好轉所致。在后期細胞因子的作用下，間充質干細胞能夠分化為成纖維細胞，并分泌Ⅱ型膠原，從而維持鼻唇溝區(qū)域一定的組織容量。但是,其具體機制并不清楚，這是未來研究所要解決的問題。本組患者在最長9個月隨訪時間內，未發(fā)現(xiàn)鼻唇溝的再次復發(fā)；此外，在注射及隨訪過程中，未出現(xiàn)任何的不良反應和并發(fā)癥，其治療的安全性也是可靠的。更為詳細、全面的治療結果需要在擴大樣本量的基礎上進行觀察和討論。

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Improvementofnasolabialfoldbycombinedinjectionofplateletrichplasmaandadipose-derivedstromalvascularfraction

XUXiang,WANGHai-bin,SUNZhong-sheng,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,GuangdongSecondProvincialPeople′sHospital,Guangzhou510317,China)

Objective To observe the safety and efficacy of platelet rich plasma (PRP) and stromal vascular fraction (SVF) combined injection in correcting nasolabial folds. Methods Thirty female subjects with significant nasolabial folds were enrolled. Peripheral venous blood was obtained from each subject and was centrifuged to produce platelet rich plasma (PRP). Autologous fat was harvested from the lateral thighs of each subject to prepare the stromal vascular fraction (SVF) using enzymatic digestion. PRP and SVF were mixed proportionally, and the mixture was injected into the deep dermis and subcutaneous tissue of the nasolabial fold. The severities of nasolabial folds were evaluated by the treating surgeon using the wrinkles assessment scale (WAS) before the treatment, immediately after the treatment, at 7 days, 1 month, 3 months, and 6 months after the treatment. Results All subjects had significant nasolabial folds improvements. There were few complications, including vascular thrombosis, injection site skin or tissue necrosis, infection, fibrosis, tissue hardening or lumps, observed during and after the injection. Mean WAS scores immediately the treatment, at 1 week, 1 month, 3 months, and 6 months after treatment were 1.22±0.54, 0.69±0.45, 0.98±0.55, 1.18±0.64, 1.23±0.72 respectively, which were significantly lower than the score before the treatment (P<0.001). Conclusion The combined injection of PRP and SVF, without using any exogenous filler, can significantly improve the nasolabial depression of middle to elderly age patients. This technique may have good clinical applications in the future.

Stromal vascular fraction； Platelet rich plasma； Nasolabial fold； Facial rejuvenation

廣東省醫(yī)學科研基金資助項目(A2013130) 作者單位：510317 廣東 廣州，廣東省第二人民醫(yī)院 整形科 第一作者：徐 翔(1974-)，男，江西人，主治醫(yī)師. 通信作者：羅盛康，510317，廣東省第二人民醫(yī)院 整形科，電子信箱：luoshengkang63@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.02.003

R

A

1673-7040(2015)02-0072-04

2014-11-04)