龍　昱，粟　敏，李　妍，羅玥佶，朱傳炳

（長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，湖南長沙410219）

曲普瑞林對(duì)人乳腺癌細(xì)胞Fas/FasL基因表達(dá)的影響*

龍昱，粟敏，李妍，羅玥佶，朱傳炳*

（長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，湖南長沙410219）

為了觀察GnRH激動(dòng)劑曲普瑞林對(duì)人乳腺癌細(xì)胞生長的影響，探討藥物處理后細(xì)胞中Fas和FasL基因的表達(dá)情況及其與細(xì)胞生長的關(guān)系，本研究采用了形態(tài)學(xué)顯微鏡觀察、MTT檢測(cè)和Real-time PCR技術(shù)，對(duì)曲普瑞林處理后乳腺癌細(xì)胞的生長增殖情況及Fas和FasL基因表達(dá)的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，曲普瑞林可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長并表現(xiàn)出了劑量依賴性，藥物濃度越大對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)。隨著藥物濃度的增大、抑制作用增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞中Fas基因的表達(dá)量逐漸增大，而FasL基因的表達(dá)量卻逐漸下降。推測(cè)曲普瑞林在作用過程中可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中Fas的表達(dá)，誘導(dǎo)了Fas所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的恢復(fù)，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的。

曲普瑞林；乳腺癌；Fas；FasL

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.010

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率已位居女性惡性腫瘤的首位。近年來，一些人工合成的促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）類似物（如曲普瑞林、阿拉瑞林等）作為腫瘤內(nèi)分泌治療的藥物已用于女性生殖系腫瘤、前列腺癌等病癥的臨床治療，可起到抑制腫瘤細(xì)胞分裂增殖的作用［1-2］。GnRH是由下丘腦神經(jīng)元分泌的一種十肽激素，是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的重要信號(hào)分子［3-4］。目前已在許多激素依賴性腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有GnRH的結(jié)合位點(diǎn)，GnRH或其類似物能作為腫瘤細(xì)胞自分泌調(diào)節(jié)因子調(diào)控腫瘤的生長和分化［5-7］。乳腺癌作為一種激素依賴性腫瘤，其癌細(xì)胞上也發(fā)現(xiàn)有GnRH及其受體的表達(dá)［8］，GnRH激動(dòng)劑可抑制癌細(xì)胞的生長，推測(cè)可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)，但具體作用機(jī)制目前尚不明確。Fas又稱為APO-1，屬于腫瘤壞死因子（TNF）受體和神經(jīng)生長因子（NGF）受體家族，是細(xì)胞凋亡的信號(hào)分子，也稱為“死亡受體”。FasL是Fas在人體內(nèi)的天然配體，當(dāng)Fas與FasL結(jié)合后，可活化并傳導(dǎo)凋亡信號(hào)，觸發(fā)Fas所在靶細(xì)胞數(shù)小時(shí)內(nèi)凋亡。研究表明多種惡性腫瘤如乳腺癌、胃癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌等組織內(nèi)有Fas/FasL的表達(dá)，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中有重要作用［9-13］。本研究以人乳腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，用不同濃度GnRH激動(dòng)劑曲普瑞林（Triptorelin）處理乳腺癌細(xì)胞，觀察藥物對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響；并對(duì)藥物處理后Fas/FasL在癌細(xì)胞中的表達(dá)水平變化進(jìn)行比較研究，分析Fas/FasL表達(dá)差異與癌細(xì)胞增殖活性的相關(guān)性，探討GnRH激動(dòng)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制生殖系腫瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，為深入研究腫瘤的內(nèi)分泌治療機(jī)理提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7（ER+）由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。DMEM培養(yǎng)基和澳洲胎牛血清購自Hyclone公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶及DNA Marker均夠自上海生工生物工程公司。曲普瑞林為白色粉末，使用前用PBS配置成所需的各種濃度。

實(shí)驗(yàn)中所使用的引物均是根據(jù)GenBank中人的Fas、FasL及內(nèi)參β-actin的mRNA序列，用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成引物。

Fas引物序列為:

上游:5′-ATTATCGTCCAAAAGTGTTAATGCCCAA-3′，

下游:5′-TGCACTTGGTGTTGCTGGTGAGTG-3′；

FasL引物序列為:

上游:5′-CACTACCGCTGCCACCCCTGA-3′，

下游:5′-CATCATCTTCCCCTCCATCATCACC-3′；

β-actin引物序列為:

上游:5′-GGCTGTTTTCCCATCCATCG-3′，

下游:5′-CCCATTCCAACCATTACTCCCTG-3′

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將1×105的處于對(duì)數(shù)生長期的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后，分別加入不同濃度的曲普瑞林（依次為10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L 6個(gè)濃度組），每個(gè)濃度均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，另外再設(shè)置對(duì)照孔和無細(xì)胞調(diào)零孔。然后置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 實(shí)驗(yàn)終止前4 h，每孔加入50 μL MTT溶液（MTT用PBS配成5 mg/ mL，即0.5%MTT）。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），置于搖床上低速振蕩10 min。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀A570nm測(cè)量各孔的吸光度值。將所測(cè)定的結(jié)果按下式計(jì)算生長抑制率IR（%）:生長抑制率IR（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均A570nm/對(duì)照組平均A570nm）×100%。實(shí)驗(yàn)全部數(shù)據(jù)借助EXCEL中的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，t檢測(cè)分析顯著性水平。

1.2.3Real-time PCR 分別收集細(xì)胞并提取其RNA，使用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。Realtime PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中各引物濃度為20 nmol/L，每管加10 μL的SYBR Green PCR Master Mix（ABI）、5 μL cDNA模板，再用無菌水定容至20 μL。Real-time PCR反應(yīng)及檢測(cè)在Prism 7 500 Sequence Detection System（ABI）上進(jìn)行。對(duì)每一種樣品的分析都重復(fù)三次，包括目標(biāo)基因（Fas、FasL）和作為內(nèi)參的管家基因（β-actin），以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。Real-time PCR的反應(yīng)條件為:50℃2 min；95℃10 min；95℃15 s，61℃45 s，40個(gè)循環(huán)。用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法2-ΔΔCt對(duì)相對(duì)定量的結(jié)果進(jìn)行分析，得到相對(duì)表達(dá)量圖譜，最后用熔解曲線法來檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR的產(chǎn)物。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1不同濃度曲普瑞林對(duì)MCF-7細(xì)胞生長的影響

用10-4～10-9mol/L濃度范圍內(nèi)的曲普瑞林分別作用于MCF-7細(xì)胞，在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，藥物對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響結(jié)果見表1和圖1。結(jié)果表明，在10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L等濃度曲普瑞林的作用下，MCF-7細(xì)胞的生長均受到了不同程度的抑制。并且隨著藥物濃度的增加，對(duì)細(xì)胞的抑制作用不斷增強(qiáng)，其中濃度為10-4mol/L的曲普瑞林對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)（24 h、48 h、72 h）MCF-7細(xì)胞生長的抑制作用均表現(xiàn)為最強(qiáng)（P＜0.01）。此外，通過觀察同種藥物濃度處理下的細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間的生長情況發(fā)現(xiàn)，48 h時(shí)的細(xì)胞抑制率較24 h時(shí)略有降低，但作用72 h時(shí)后，細(xì)胞抑制率又明顯增大。說明隨著藥物作用時(shí)間的延長，藥物對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用有明顯增強(qiáng)。

表1　曲普瑞林對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增生活性影響的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1　The MTT experimental results of the effect of triptorelin on the growth of breast cancer cells

圖1　不同濃度曲普瑞林處理24 h、48 h、72 h后MCF-7細(xì)胞的生長情況Fig.1　The growth of MCF-7 cells treated by different concentrations of triptorelin after 24 h，48 h and 72 h

2.2Fas及FasL基因表達(dá)的半定量分析

經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藥物處理72 h后，各種濃度的曲普瑞林對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制作用均表現(xiàn)出最強(qiáng)，因此選擇藥物處理72 h后的細(xì)胞進(jìn)行Fas和FasL表達(dá)量的分析。不同濃度曲普瑞林處理72 h后，MCF-7細(xì)胞中Fas和FasL表達(dá)的Real-time PCR結(jié)果分別見圖2和圖3。溶解曲線和PAGE膠檢測(cè)結(jié)果均顯示擴(kuò)增產(chǎn)物單一且大小符合預(yù)期設(shè)計(jì)。由圖2可見，F(xiàn)as基因在無藥物處理的MCF-7細(xì)胞中表達(dá)量較低，但經(jīng)過不同濃度曲普瑞林處理72 h后，F(xiàn)as基因在細(xì)胞中的表達(dá)量隨著藥物濃度的增加而增大，其中10-4mol/L藥物處理后的細(xì)胞中Fas基因的表達(dá)量最高，10-9mol/L藥物處理后的細(xì)胞中Fas基因的表達(dá)量最低。

圖2　不同濃度曲普瑞林處理后MCF-7細(xì)胞中Fas基因表達(dá)情況Fig.2　The expression of Fas gene in MCF-7 cells treated by different concentrations of triptorelin control

而由圖3可見，F(xiàn)asL基因在無藥物處理的MCF-7細(xì)胞中表達(dá)量較高，在經(jīng)過不同濃度曲普瑞林處理72 h后，F(xiàn)asL基因在細(xì)胞中的表達(dá)量隨著藥物濃度的增加而逐漸降低，其中10-9mol/L藥物處理后的細(xì)胞中FasL基因的表達(dá)量最高，10-4mol/L藥物處理后的細(xì)胞中FasL基因的表達(dá)量最低。這與上述Fas基因的表達(dá)情況相反。

圖3　不同濃度曲普瑞林處理后MCF-7細(xì)胞中FasL基因表達(dá)情況Fig.3　The expression of FasL gene in MCF-7 cells treated by different concentrations of triptorelin control

3　討論

實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察都提示，在一些激素依賴性腫瘤如宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌及乳腺癌等的細(xì)胞中均存在GnRH結(jié)合位點(diǎn)［5-7］，GnRH可作為調(diào)節(jié)因子調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、分化。而在使用GnRH類似物對(duì)卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌及乳腺癌的治療中也發(fā)現(xiàn)其對(duì)相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞的生長有抑制作用［1，14-15］，但具體機(jī)制尚不十分清楚，推測(cè)其可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)系［16-18］。本實(shí)驗(yàn)中使用的曲普瑞林為人工合成的GnRH激動(dòng)劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)曲普瑞林能抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長，藥物濃度越高，抑制作用越明顯，表現(xiàn)出了劑量依賴性。并且隨著藥物處理時(shí)間的延長，72 h后藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用要明顯高于24 h和48 h，說明藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng)。

Fas/FasL系統(tǒng)是細(xì)胞凋亡中最主要的途徑之一，F(xiàn)as是細(xì)胞凋亡的信號(hào)，當(dāng)其與配體FasL結(jié)合后，活化并傳導(dǎo)凋亡信號(hào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)很多腫瘤細(xì)胞上都有Fas抗原的表達(dá)，這些腫瘤可通過Fas反攻擊模式作為逃避機(jī)體免疫識(shí)別和殺傷的方式，腫瘤細(xì)胞通過低表達(dá)或不表達(dá)Fas而自身表達(dá)FasL來誘導(dǎo)腫瘤組織中浸潤的淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而得以逃避免疫細(xì)胞的殺傷及自身的凋亡作用。比如，在一些腫瘤（如卵巢癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、黑色素瘤、肝癌等）的發(fā)展過程中伴有腫瘤細(xì)胞中Fas的表達(dá)下調(diào)或缺失，使細(xì)胞對(duì)Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗，從而使得腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)控而存活，引起腫瘤增殖［9，19］。此外，在對(duì)肺癌、子宮內(nèi)膜癌的研究中發(fā)現(xiàn)Fas與FasL表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，隨著癌細(xì)胞惡性程度的增加，F(xiàn)as下調(diào)明顯，F(xiàn)asL表達(dá)水平則增高，其逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的能力也逐步增強(qiáng)，轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［20］。而在一些腫瘤如宮頸癌的化學(xué)治療后，可以觀察到癌細(xì)胞增殖活性受抑制并出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象的同時(shí)，還伴隨有Fas表達(dá)的上升和FasL表達(dá)的下降［21］。

本實(shí)驗(yàn)中我們利用不同濃度的GnRH激動(dòng)劑曲普瑞林處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7后，使用Real-time PCR方法檢測(cè)了Fas/FasL基因表達(dá)量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在無藥物處理的腫瘤細(xì)胞中，F(xiàn)as的表達(dá)量相對(duì)較低，而FasL的表達(dá)量相對(duì)較高，這與其他乳腺癌發(fā)生發(fā)展研究中所觀察到的Fas下調(diào)和FasL上調(diào)的結(jié)果相似［22］。而在曲普瑞林的作用下，隨著藥物濃度的增大、抑制作用的增強(qiáng)，MCF-7細(xì)胞中Fas的表達(dá)量逐漸增加，但FasL的表達(dá)量相對(duì)于無藥物處理時(shí)反而出現(xiàn)了降低。這說明曲普瑞林在作用過程中可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞中Fas的表達(dá)，但抑制了FasL的表達(dá)，從而誘導(dǎo)了Fas所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的恢復(fù)，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的。

因此，我們認(rèn)為GnRH激動(dòng)劑曲普瑞林對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長有一定的抑制作用，并且這種抑制作用與刺激濃度及作用時(shí)間有關(guān)系。推測(cè)曲普瑞林作為臨床上的腫瘤內(nèi)分泌治療的藥物，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與其誘導(dǎo)了Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的恢復(fù)，從而抑制了癌細(xì)胞的生長有一定關(guān)系。但Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡本身是一個(gè)復(fù)雜的過程，更具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

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Effect of Triptorelin on Fas/FasL Gene Expression in Human Breast Cancer

LONG Yu，SU Min，LI Yan，LUO Yueji，ZHU Chuanbing*
（Department of Biochemistry and Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，Changsha Medical University，Changsha 410219，Hunan，China）

In order to observe the effect of GnRH aganist triptorelin on the growth of human breast cancer cells，and to explore the expression of Fas and FasL gene in drug treated cells and its relationship with cell growth，the morphological microscope，MTT detection and Real-time PCR were used to study the proliferation and the expression of Fas and FasL gene of breast cancer cells which were treated by the triptorelin.The results showed that triptorelin could inhibit the growth of breast cancer cells MCF-7 and exhibited a characteristic of dose-dependent，the higher the concentration of drugs，the stronger inhibition of tumor cells.It was also observed that the higher the concentration of reagents，the expression of Fas gene in breast cancer cells gradually increased，but the expression of FasL gene was gradually decreased. Therefore，it suggested that the triptorelin might promote the expression of Fas gene in tumor cells，which induced the recovery of the Fas mediated apoptosis pathway，then the growth of tumor cells were inhibited.

triptorelin；breast cancer；Fas；FasL

R737.9

A

1007-7146（2015）04-0358-06

2015-05-02；

2015-06-12

湖南省科技廳科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2011FJ3096）；湖南省教育廳科學(xué)研究資助項(xiàng)目（No.10C0467）

龍昱（1982-），女，土家族，湖南長沙人，副教授，博士，主要從事內(nèi)分泌學(xué)及腫瘤生物化學(xué)研究。（手機(jī)）13787129182；（電子郵箱）19429068@qq.com

朱傳炳（1948-），男，湖南長沙人，教授，學(xué)士，主要從事心臟發(fā)育的基因調(diào)控及分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究。（手機(jī)）13787006775；（電子郵箱）12298634@qq.com