牛嬌，曾東，李芹，王生，常津，王悅，張連云△

實驗研究

鹽酸利多卡因葡聚糖基納米類脂質(zhì)體的透皮研究

牛嬌1，曾東1，李芹2，王生3，常津3，王悅1，張連云1△

目的 探討采用葡聚糖基納米類脂質(zhì)體為載體包載利多卡因（LID-HLD-BNs）的表面麻醉劑的體外透皮性能及在體透皮特征。方法 以包載利多卡因的傳統(tǒng)脂質(zhì)體（LID-CLs）和鹽酸利多卡因注射液（LID-IJ）為對照，使用離體小鼠腹部皮膚，采用Franz擴散池，高效液相色譜法進(jìn)行體外透皮實驗，觀察LID-HLD-BNs的透皮性能。以鈣黃綠素為探針，運用激光共聚焦顯微鏡（CLSM），以載鈣黃綠素的傳統(tǒng)脂質(zhì)體（鈣黃綠素-CLs）和游離鈣黃綠素為對照，觀察該類脂質(zhì)體制劑（鈣黃綠素-HLD-BNs）在活體小鼠腹部的熒光透皮情況。結(jié)果 LID-HLD-BNs單位面積累積透皮量和透皮速率高于LID-CLs和LID-IJ。LID-IJ、LID-CLs、LID-HLD-BNs的透皮速率分別為39.15、79.04和142.86 μg（/cm2·h），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在體熒光透皮實驗中，鈣黃綠素-HLD-BNs組的透皮速度和透皮深度均明顯大于鈣黃綠素-CLs組和游離鈣黃綠素組。結(jié)論 葡聚糖基納米類脂質(zhì)體具有良好的經(jīng)皮滲透性能。

投藥，皮膚；脂質(zhì)體；利多卡因；色譜法，液相；藥物利用；體外研究

經(jīng)表面涂布、透皮滲透產(chǎn)生滿意的麻醉效果，是口腔醫(yī)師高度關(guān)注的研究課題。局麻藥物透皮滲透的量及速率是影響局麻效果的重要因素。為此，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了許多研究和探索，如采用理化促滲方法、幾種麻醉藥物制成復(fù)合制劑以及將局麻藥載入滲透性強的載體等［1］，其中應(yīng)用安全、穩(wěn)定、滲透性高的脂質(zhì)體載體透皮是目前研究的熱點之一［2］。類脂質(zhì)體以非離子型表面活性劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)脂質(zhì)體中易氧化的磷脂［3］，不但具有傳統(tǒng)脂質(zhì)體的優(yōu)點而且更加穩(wěn)定。鹽酸利多卡因（LID）是臨床上常用的口腔局麻藥物，理化性質(zhì)穩(wěn)定、起效快、毒性小，但滲透性差、表面麻醉效果不理想［4］。本實驗采用賴氨酸、亞油酸、葡聚糖代替磷脂和膽固醇合成的葡聚糖類納米類脂質(zhì)體包載鹽酸利多卡因（LID-HLD-BNs），以包載利多卡因的傳統(tǒng)脂質(zhì)體（LID-CLs）和鹽酸利多卡因注射液（LID-IJ）為對照，通過動物離體和在體透皮實驗，評價其經(jīng)皮滲透性能，探討其作為口腔表面麻醉藥的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司），RYJ-6A型藥物透皮擴散實驗儀（上海黃海藥檢儀器有限公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM，德國Bruker公司），CM-1900型冰凍切片機（德國LeiCa公司）。

1.1.2 實驗試劑 LID-HLD-BNs（粒徑54.1 nm），LID-CLs（粒徑250 nm），天津大學(xué)材料學(xué)院納米生物技術(shù)研究所實驗室在同一條件下合成，LID含量2%；LID-IJ，0.02 g/L，LID含量2%，批號20110312，上海禾豐制藥有限公司；HLD-BNs包載鈣黃綠素及CLs包載鈣黃綠素，均是0.05%（W/W），天津大學(xué)材料學(xué)院納米生物技術(shù)研究所實驗室合成［5］。

1.1.3 實驗動物 SPF級昆明種小鼠，5周齡，雌雄不拘，體質(zhì)量（20±2）g，購自天津醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 高效液相色譜法（HPLC）的建立 色譜條件［6］為色譜柱：Agilent zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相條件：甲醇∶0.01 mol/L磷酸二氫鈉（3∶1，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：260 nm；進(jìn)樣量：20 μL。在上述色譜條件下測定，該HPLC檢測方法的專一性良好，在本色譜條件下，LID峰形良好，無雜質(zhì)峰干擾。得到LID的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為=0.051X-2.701，r=0.999 9，在0.5～500 mg/L之間線性關(guān)系良好。日內(nèi)精密度為0.88%～1.01%，日間精密度為0.85%～1.35%?；厥章蕿?9.5%～102.2%。

1.4 在體熒光標(biāo)記透皮研究 （1）實驗分組：按干預(yù)方式不同分為游離鈣黃綠素組（陰性對照）、鈣黃綠素-CLs組（陽性對照）和鈣黃綠素-HLD-BNs組，每組9只小鼠。實驗前1 d腹部去毛。（2）在體熒光標(biāo)記透皮實驗：小鼠以戊巴比妥鈉麻醉后仰臥固定，避光于下腹部中央均勻涂抹藥物0.15 mL。給藥后0.5、1.0、1.5 h處死（每個時間點每組小鼠3只），取給藥區(qū)中央約1 cm2皮膚縱向切片［7］，切片厚度5 μm，激光共聚焦顯微鏡分析。儀器參數(shù)設(shè)置為最大激發(fā)波長和發(fā)射波長為Excitation Beam Splitter FW TD 488/543/633 nm，20×ob?jective，PMT 700 V，Zoom 2.81，Pinhole 1.88 airy。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對3組藥物各時間點單位面積累積透皮量Q進(jìn)行重復(fù)測量方差分析，對透皮速率進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外透皮實驗 3組藥物單位面積LID累積透皮量隨作用時間增加逐漸增加，15 min～12 h中，累積透皮量總體趨勢LID-HLD-BNs＞LID-CLs＞LIDIJ，見圖1。3組藥物的透皮速率間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

Fig.1 Curve of cumulative transdermal quantity-time of LID in three groups圖1 3組藥物單位面積LID累積透皮量-時間（Q-t）曲線

Tab.1 Regression equation of transdermal quantity with time in three groups表1 3組藥物單位面積LID累積透皮量與時間的回歸方程

2.2 在體熒光透皮實驗 游離鈣黃綠素組在0.5、1.0、1.5 h時，熒光僅局限于角質(zhì)層表面，說明游離鈣黃綠素并不能透過角質(zhì)層。0.5 h時，鈣黃綠素-CLs組熒光局限于角質(zhì)層，而鈣黃綠素-HLD-BNs組已透過角質(zhì)層；1.0 h時，鈣黃綠素-CLs組熒光穿過表皮的1/5，鈣黃綠素-HLD-BNs組達(dá)到1/3；1.5 h時，熒光透過鈣黃綠素-CLs組表皮的1/3，而鈣黃綠素-HLD-BNs組熒光透過表皮全層，且顯示較強的熒光強度，見圖2。

3 討論

3.1 新型脂質(zhì)體良好的透皮性能 LID-HLD-BNs為合作實驗室采用葡聚糖基新型納米類脂質(zhì)體包載鹽酸利多卡因而成，相比較傳統(tǒng)脂質(zhì)體，葡聚糖基類脂質(zhì)體粒徑更小，帶有更多的正電荷，穩(wěn)定性更好。LID-CLs和LID-HLD-BNs均具有兩親性，故均能透過皮膚表面，而LID-HLD-BNs具有更小的粒徑（僅54.1 nm），明顯小于LID-CLs（250 nm），其滲透速度及滲透量明顯大于LID-CLs。另外，生理條件下，皮膚黏膜表面呈負(fù)電荷，故帶正電荷的脂質(zhì)體易與皮膚黏膜表面結(jié)合［8］。LID-HLD-BNs表面正電荷更多，與皮膚表面親和力更強。

3.2 體外和在體透皮實驗的聯(lián)合應(yīng)用 目前Franz擴散池廣泛應(yīng)用于藥物的體外透皮滲透實驗，可以比較形象地模擬藥物在生物體內(nèi)的釋放情況，對臨床應(yīng)用具有重要意義［9］。本研究建立的HPLC色譜方法專一性好，HLD-BNs、空白透皮液對LID檢測均無影響，可精確定量檢測皮膚滲透性實驗中LID的透過量。3組藥物單位面積的累積透皮量Q：LID-HLD-BNs＞LID-CLs＞LID-IJ，LID-HLD-BNs的滲透速率分別是LID-IJ、LID-CLs的3.65倍和1.81倍。近年來，CLSM作為一種新型的透皮分析技術(shù)開始應(yīng)用于藥物的透皮給藥研究，CLSM能應(yīng)用于藥物對活體組織的透皮研究，并使藥物透皮過程可視化［10-11］。鈣黃綠素與LID均為水溶性，文獻(xiàn)報道其可作為透皮研究的熒光標(biāo)志物［12］，因此本研究用其代替LID來研究該體系的透皮滲透情況，結(jié)果顯示鈣黃綠素-HLD-BNs組各時間點熒光深度和熒光量均大于鈣黃綠素-CLs組，證明無論透皮深度還是透皮量，葡聚糖基類脂質(zhì)體均具有一定優(yōu)勢。

綜上所述，與包載利多卡因的傳統(tǒng)脂質(zhì)體及利多卡因注射液相比，包載利多卡因的葡聚糖基納米類脂質(zhì)體具有更優(yōu)越的透皮性能，可有效增加藥物的透皮量和滲透深度，從而提高表面麻醉效果，為口腔臨床無痛治療提供良好的前景。

（圖2見插頁）

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（2014-10-24收稿 2014-12-30修回）

（本文編輯 李鵬）

Percutaneous permeability of lidocaine hydrochloride loaded destran-based niosomes

NIU Jiao1，ZENG Dong1，LI Qin2，WANG Sheng3，CHANG Jin3，WANG Yue1，ZHANG Lianyun1△
The Stomatological Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China
△Corresponding Author E-mail：zhly@tijmu.edu.cn

Objective To study the percutaneous permeability through mouse skin of lidocaine hydrochloride-loaded destran-based niosomes（LID-HLD-BNs）in vitro and in vivo.Methods HPLC was employed to exam lidocaine hydrochlo?ride.Lidocaine hydro-chloride-loaded conventional liposomes（LID-CLs）and lidocaine hydrochloride injection（LID-IJ）were used as control.Isolated mouse skin was added into Franz diffusion cell to evaluate the permeability of LID-HLD-BNs in vitro.Confocal Laser Scanning Microscopy（CLSM）was used to observe the permeation depth of mouse skin in vivo.Re?sults The permeation rate and cumulative permeation amount were significantly higher in LID-HLD-BNs group than those of LID-CLs and LID-IJ groups（P＜0.05）.CLSM studies also confirmed that HLD-BNs reached deeper layers of the skin.Conclusion LID-HLD-BNs has good transdermal ability.

administration，cutaneous；liposomes；lidocaine；chromatography，liquid；drug utilization；in vitro

R943.43

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.005

國家自然科學(xué)基金資助項目（81070871）；天津市自然科學(xué)基金重點項目（11JCZDJC20400）

1天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院（郵編300070）；2天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院藥理學(xué)教研室；3天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院納米生物技術(shù)研究所

牛嬌（1988），女，碩士在讀，主要從事表面麻醉劑研究

△E-mail：zhly@tijmu.edu.cn