呂銘瀟，張 騫（. 山東服裝職業(yè)學(xué)院，山東 泰安 7000；. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安 7000）

10 種生物源藥劑對(duì)家蠶的毒性測(cè)定及中毒反應(yīng)觀察

呂銘瀟1，張 騫2
（1. 山東服裝職業(yè)學(xué)院，山東 泰安 271000；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安 271000）

測(cè)定 10 種生物源類農(nóng)藥對(duì)家蠶的急性毒性，并系統(tǒng)地觀察家蠶中毒反應(yīng)癥狀。對(duì)其毒性分級(jí)：抗生素類殺蟲劑中，阿維菌素和多殺霉素屬于劇毒級(jí)；昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑中，蟲酰肼屬于劇毒級(jí)，氟鈴脲、吡丙醚屬于低毒級(jí)；沙蠶毒素類殺蟲劑中，殺蟲單屬于高毒級(jí)；植物殺蟲劑中，印楝素和苦參堿屬于低毒級(jí)；微生物殺蟲劑中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒屬于劇毒級(jí)，蘇云金桿菌屬于低毒級(jí)。同時(shí)，雖然同屬于生物源農(nóng)藥大類，不同作用機(jī)理的藥劑，甚至是相同作用機(jī)理的藥劑，處理家蠶后中毒表征也存在明顯差異；而出現(xiàn)相同的中毒反應(yīng)癥狀的家蠶，所對(duì)應(yīng)藥劑的作用毒理并不一定相同。

生物源類農(nóng)藥；家蠶；毒性評(píng)價(jià)

呂銘瀟， 張騫.10種生物源藥劑對(duì)家蠶的毒性測(cè)定及中毒反應(yīng)觀察［J］. 生物災(zāi)害科學(xué)， 2015， 38（4）:366-370.

家蠶（Bombyx mori ）是中國(guó)古代最為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲之一，在中國(guó)已有5 000多年的歷史，而且至今其還是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，在出口貿(mào)易中也占了相當(dāng)比例。與此同時(shí)，因其是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)農(nóng)藥及其他化學(xué)品十分敏感的動(dòng)物，所以家蠶還是我國(guó)農(nóng)藥登記試驗(yàn)所必需的非靶標(biāo)生物資源之一。由于未系統(tǒng)地掌握農(nóng)藥的科學(xué)安全高效使用方法，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中家蠶的中毒事件頻頻發(fā)生［1-3］。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)的重視，對(duì)有害化學(xué)物質(zhì)的使用提出了更高的要求。因非靶標(biāo)生物可以作為農(nóng)藥毒性測(cè)定試驗(yàn)的材料，亦是受到了更高的關(guān)注。鑒于此，國(guó)內(nèi)外對(duì)非靶標(biāo)生物之一——家蠶毒性評(píng)價(jià)的研究越來越多［4-7］，試驗(yàn)條件和方法也在不斷改進(jìn)［4，7-9］。

隨著農(nóng)藥制劑產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，農(nóng)藥的多元復(fù)配和助劑的多樣混配，使農(nóng)藥制劑的毒性千變?nèi)f化。而這些藥劑對(duì)桑園及其養(yǎng)蠶業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)未確定，必須及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。高毒以及劇毒農(nóng)藥不能用在桑園周邊，但是生產(chǎn)中人們普遍認(rèn)為生物源農(nóng)藥對(duì)家蠶毒性較低，風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較小，然而因此引起污染桑園的情況時(shí)有發(fā)生。因此，為了明確低度的生物源殺蟲劑對(duì)家蠶的安全性，本文遵照國(guó)家環(huán)境保護(hù)局頒布的“化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則”的要求［10］， 采用食下毒葉法為10種生物源農(nóng)藥進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)。

1　材料與方法

1.1 試劑及材料

1.1.1 試驗(yàn)藥劑 以下農(nóng)藥制劑由農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所生物技術(shù)研究測(cè)試中心提供：抗生素類殺蟲劑：阿維菌素（Abamectin， 5% EC），多殺霉素（Spinosad， 80% WP）；昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑：蟲酰肼（Tebufenozide， 20%米滿 SC），氟鈴脲（ Hexafluron， 5% EC），吡丙醚（ Pyriproxyfen， 10% EC）；沙蠶毒素類殺蟲劑：殺蟲單（Molosultap， 5% GR）；植物殺蟲劑：印楝素（ Azadirachtin， 0.3% EC），煙堿（Nicotine， 10% EC）；微生物殺蟲劑：苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（ Autographa califomica NPV， 10×109PB/mL SC），蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis， 7 000 IU/mg TC）。

1.1.2 使用儀器見表1

表1　主要使用儀器

1.1.3 飼養(yǎng)用具 搪瓷盆（250 mm×150 mm×50 mm）、上蔟架、鑷子、毛筆、養(yǎng)蟲盆、生石灰、黑紗布、玻璃板等。

1.1.4 其他材料 培養(yǎng)皿（直徑 9 cm、15 cm）、移液管、吸耳球、燒杯、玻璃棒、夾子等。

2.2 試蟲及飼養(yǎng)方式

實(shí)驗(yàn)所需試蟲為2齡幼蠶（本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)）。影響農(nóng)藥對(duì)家蠶毒力大小的因素有：家蠶品種、桑樹品種，幼蟲齡期、發(fā)育階段，培養(yǎng)間溫度、濕度等因素有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道［10］顯示，除了蟻蠶之外，2齡幼蠶對(duì)農(nóng)藥影響最為敏感，且之后隨齡期增大而降低；但其又提到，在幼蠶進(jìn)入5齡暴食期中、后期后，對(duì)藥物的敏感性反而增大；亞致死劑量的農(nóng)藥導(dǎo)致家蠶結(jié)繭受阻或結(jié)繭畸形，繭重下降，蠶蛹死亡率上升，雌蛾產(chǎn)卵總數(shù)減少，孵化率顯著降低。綜合比較后選用2齡蠶作為急性毒性試驗(yàn)材料，5齡蠶可作為家蠶慢性毒性試驗(yàn)材料［11］。

2.2.1 試驗(yàn)幼蠶 品種為春蕾?鎮(zhèn)珠，于山東濰坊廣通蠶種集團(tuán)有限公司購置。用常規(guī)方法催青和飼養(yǎng)。為做到不同時(shí)間內(nèi)有相同齡期的幼蠶，試驗(yàn)用蠶采用分批催青孵化以保障試驗(yàn)需求。

2.2.2 幼蠶飼養(yǎng) （1）催青。培養(yǎng)間溫度控制在23℃，濕度保持在 70%～80%。將蠶種平放在已滅菌培養(yǎng)皿中，每天同一時(shí)刻記錄催青室的溫、濕度及蠶種的性狀變化情況。當(dāng)蠶種出庫催青到第 8天，可見到蠶卵的一端出現(xiàn)有一小黑點(diǎn)，習(xí)慣稱蠶卵“點(diǎn)青”。當(dāng)一張蠶種已有“點(diǎn)青卵”達(dá) 20%時(shí)，立即把蠶種進(jìn)行遮黑處理。第 11 天早晨除去遮光物，開燈感光，使蠶蟻咬破卵殼而出（孵化）。

（2）收蟻。一般采用桑葉引誘。收蟻宜在上午 09：00—10：00 進(jìn)行。選用頂芽下第二嫩片桑葉作為收蟻葉，剪成細(xì)絲狀，并將其均勻撒在有蟻蠶的蠶連紙上，經(jīng)直至大部分蟻蠶爬上桑葉。

（3）飼養(yǎng)。文獻(xiàn)報(bào)道，溫濕度對(duì)家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育影響較大。幼齡蠶要在高溫多濕環(huán)境條件下飼養(yǎng)才能發(fā)育正常。1 齡蠶室溫度宜 28 ℃，干濕差 1 ℃，2～3 齡宜 26～27 ℃，干濕差 1～1.5 ℃。喂小蠶的桑葉采用自頂芽下第 3 片葉，飼喂時(shí)間為每天的 6、11、17、22 時(shí)。大蠶期加強(qiáng)室內(nèi)空氣流通，防止高溫多濕，防悶熱。大蠶食量大，活動(dòng)性強(qiáng)，因此要盡量疏放，防止過密互相抓傷感染蠶病。在飼養(yǎng)過程中時(shí)刻保持蠶室清潔衛(wèi)生，發(fā)現(xiàn)病蠶、弱蠶立即清除，防治染病傳病。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 食下毒葉法 采用國(guó)家化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則中推薦的食下毒葉法［12，13］，并略加改動(dòng)。將藥劑用水稀釋成 5～7 個(gè)系列濃度，從桑樹上采集第 2、3 片健康的葉片，去除浮土等雜質(zhì)，依次從低濃度的藥液到高濃度藥液浸漬桑葉，使桑葉浸藥均勻，原則是盡量使藥液均勻浸在桑葉上，浸葉時(shí)間應(yīng)控制為 10 s。浸藥后將桑葉在通風(fēng)處風(fēng)干并將葉片剪成細(xì)絲狀，供家蠶食用。將藥劑處理的桑葉放入養(yǎng)蟲皿中，每皿接入 20 頭家蠶幼蟲（2齡第 2 天）。重復(fù) 3 次共計(jì) 60 頭。以清水浸桑葉為空白對(duì)照組。處理后的試蟲置于 26 ℃恒溫養(yǎng)蟲室內(nèi)連續(xù)食毒葉 96 h。

2.3.2 檢查結(jié)果 分別在實(shí)驗(yàn)后的 24 h，48 h和 96 h檢查家蠶的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用毛筆筆尖觸碰試蟲，若身體不動(dòng)則視為死亡。記錄死亡桑蠶的試蟲數(shù)目，同時(shí)記錄存活個(gè)體的中毒癥狀。計(jì)算桑蠶的死亡率以及校正死亡率。

計(jì)算死亡率以及校正死亡率的計(jì)算公式如下：

3　結(jié)果與分析

3.1 中毒癥狀觀察

從表 2 可以看出有些屬不同類別的殺蟲劑對(duì)家蠶引起的中毒癥狀表現(xiàn)出多種相似的特征，如阿維菌素和氟鈴脲均有吐液、拒食、身體扭曲呈“C”或“S”形等癥狀；有些同屬一個(gè)類別的藥劑中毒癥狀表現(xiàn)出異樣：抗生素類藥劑阿維菌素出現(xiàn)翹頭翹尾癥狀，多殺霉素出現(xiàn)蠶體側(cè)翻等現(xiàn)象；昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中蟲酰肼可使部分家蠶提前蛻皮，氟鈴脲導(dǎo)致家蠶不能正常蛻皮；殺蟲單和煙堿引起的家蠶拒食反應(yīng)強(qiáng)度不如其他藥劑。

3.2 毒性評(píng)價(jià)

比較 10 種殺蟲劑對(duì)家蠶的 96 h的 LC50值（表 3）， 按毒力大小排列依次為：阿維菌素＞苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒＞氟鈴脲＞多殺霉素＞蟲酰肼＞殺蟲單＞煙堿＞印楝素＞吡丙醚＞蘇云金桿菌。其中屬于抗生素類的阿維菌素對(duì)家蠶的毒性最高；微生物源類農(nóng)藥蘇云金桿菌對(duì)家蠶的毒性最低。

表2　家蠶接觸藥劑后的中毒癥狀觀察

表3　藥劑對(duì)家蠶的毒性

表4　農(nóng)藥對(duì)家蠶的毒性與風(fēng)險(xiǎn)性等級(jí)劃分

3.3 毒性分級(jí)及風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)價(jià)

依據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》（表 3），在本實(shí)驗(yàn)室條件下，蘇云金桿菌、印楝素、吡丙醚對(duì)家蠶急性毒性等級(jí)劃分為“低毒”，風(fēng)險(xiǎn)性等級(jí)低；殺蟲單、煙堿對(duì)家蠶急性毒性等級(jí)劃分為高毒，風(fēng)險(xiǎn)性等級(jí)高；阿維菌素、多殺霉素、蟲酰肼、氟鈴脲、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對(duì)家蠶急性毒性等級(jí)劃分為劇毒，風(fēng)險(xiǎn)性等級(jí)極高。

4　討　論

本研究旨在對(duì)10種生物源類農(nóng)藥對(duì)家蠶的急性毒性分級(jí)、觀察家蠶的中毒癥狀以及分析農(nóng)藥對(duì)不同家蠶品種的毒性差異。同時(shí)，為化學(xué)防治桑園害蟲和蠶農(nóng)科學(xué)用藥提供理論支持及技術(shù)指導(dǎo)，并對(duì)多種農(nóng)藥進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)，為其農(nóng)藥的登記及安全使用提供必要的環(huán)境毒理學(xué)資料。

大部分生物源農(nóng)藥對(duì)人畜安全無毒，即不污染環(huán)境，又不直接影響作物的產(chǎn)量。對(duì)靶效應(yīng)較高，專一性強(qiáng)，對(duì)靶標(biāo)昆蟲天敵及其他有益生物無毒害影響，有利于保持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定。但是家蠶作為一種模式昆蟲，由于長(zhǎng)期受到人類馴化，部分抗藥性基因逐漸退化消失，導(dǎo)致其耐受性降低，易感病。本實(shí)驗(yàn)中的10種生物源殺蟲劑，5種為劇毒級(jí)別，只有3種農(nóng)藥為低毒級(jí)別。可以看出，大部分生物源類農(nóng)藥在桑園及桑園周邊環(huán)境中使用對(duì)家蠶危害的風(fēng)險(xiǎn)較高。因此，在養(yǎng)蠶區(qū)桑園及其周邊環(huán)境應(yīng)避免使用這一類農(nóng)藥防治害蟲。盡量選擇使用對(duì)家蠶風(fēng)險(xiǎn)性小的藥劑，并注意藥劑的安全使用間隔期。如需防治桑園周邊環(huán)境中其它作物害蟲時(shí)，則應(yīng)避免在有風(fēng)天氣施藥，并嚴(yán)格控制施藥方法、施藥時(shí)間和施藥時(shí)期；避免在桑園附近配藥，如果需要噴藥時(shí)嚴(yán)禁霧滴向桑園飄移；進(jìn)行噴藥作業(yè)所污染的衣物、器具即其他材料，應(yīng)注意不要帶入養(yǎng)蠶園區(qū)內(nèi)。在養(yǎng)蠶區(qū)噴灑過其他藥劑時(shí)，噴霧器應(yīng)清洗干凈再使用，以免二次污染造成蠶區(qū)經(jīng)濟(jì)損失［14-15］。

同時(shí)觀察了中毒癥狀，也證明了不同作用靶標(biāo)以及相同作用靶標(biāo)不同種類殺蟲劑對(duì)家蠶的中毒情況影響不同。同時(shí)，雖然同屬于生物源農(nóng)藥大類，不同作用機(jī)理的藥劑，甚至是相同作用機(jī)理同的藥劑，處理家蠶后中毒表征存在明顯差異；而 出現(xiàn)相同的中毒反應(yīng)癥狀的家蠶，所 對(duì)應(yīng)藥劑的作用毒理并不一定相同。針對(duì)出現(xiàn)的中毒癥狀差異，不能以此作為區(qū)分藥劑的毒性的標(biāo)準(zhǔn)，還應(yīng)該同時(shí)測(cè)量中毒后家蠶體內(nèi)解毒酶系的變化量，從酶學(xué)的角度來觀察家蠶對(duì)農(nóng)藥制劑的耐受程度。

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［15］ 張大弟， 張曉紅. 農(nóng)藥污染與防治［M］. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社，2001.

Toxicity of Ten Biological Source Pesticides to Silkworm Bombyx mori L.

LYU Ming-xiao1，ZHANG Qian2
（1. Shandong Vocational Institute of Clothing Technology， Taian 271000， China； 2. ShandongAgricultural University， Taian 271000， China）

Abstrct: Of antibiotic insecticides， abamectin and neomycin， are at highly toxic level； of insect growth regulator insecticides， oxygen tebufenozide is at a highly toxic level， while hexaflumuron and Pyriproxyfen are at a low toxicity level； of nereis toxic insecticides， inmonosultap is at a highly toxic level； of plant pesticides，neem Su nicotine and matrine wolves are at low toxicity level； of microbial insecticides， autographa nuclear polyhedrosis virus belongs to super high toxic level， while bacillus thuringiensis is at low toxicity level. So， on the same silkworm， different pesticide may have different effects.

biological source pesticide； silkworm； toxicity evaluation

S884.9

A

2095-3704（2015）04-0366-05

2015-11-02

呂銘瀟，女，碩士，主要從事生物化學(xué)教學(xué)工作，E-mail: zhangcarlman@126.com。