劉清銀，李婭妮，涂斌，周玉杰，胡曉丹，劉小慶

濾紙干血片法篩查孕中期唐氏綜合征的可行性研究

劉清銀，李婭妮＊，涂斌，周玉杰，胡曉丹，劉小慶

目的探討對濾紙干血片洗脫液中血清甲胎蛋白（AFP）和游離β-人絨毛膜促性腺激素（游離βhCG）的含量檢測，應(yīng)用于孕中期婦女唐氏（Down’s）綜合征產(chǎn)前篩查的可行性。方法應(yīng)用自動微粒子化學發(fā)光法（CLEIA）檢測1260例孕婦濾紙干血片法標本中AFP與游離β-hCG的含量與常規(guī)血清法所測含量比較。結(jié)果干血片法檢測AFP含量的變異度為2.1%～6.5%；回收率為96.2%；靈敏度為0.5 ng/ml；游離β-hCG含量的變異度為3.9%～6.7%；回收率為98.4%；靈敏度為0.5 ng/ml；該研究共74例為陽性，陽性率為5.9%，其中1例已確診為唐氏綜合征胎兒，與血清學篩查結(jié)果的符合率為98.89%。結(jié)論采用濾紙干血片法替代血清學方法測定孕中期女性血中AFP和游離β-hCG的含量，用血少，成本較低，方便快捷，篩查結(jié)果準確可靠。

濾紙干血片；唐氏綜合征；甲胎蛋白；游離β-人絨毛膜促性腺激素

檢測孕婦血清中的甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、游離β-人絨毛膜促性腺激素（free betahuman chorionic gonadotropin，游離β-hCG）兩種生化標志物作為孕中期唐氏綜合征篩查已開展多年［1］。但抽取靜脈血的標本不易保存（國家要求唐氏綜合征篩查標本保留2年）、運送具有潛在生物安全隱患等問題，影響了唐氏綜合征產(chǎn)前篩查的大規(guī)模展開。

濾紙是血液的極好載體。制作濾紙干血片方法簡單、需血量少、保存運輸方便等優(yōu)點，已在新生兒疾病篩查中廣泛應(yīng)用［2］。該研究將濾紙血片應(yīng)用于唐氏綜合征產(chǎn)前篩查，采用自動微粒子化學發(fā)光法（CLEIA）檢測孕中期濾紙干血片洗脫液中AFP、βhCG的含量，旨在探討濾紙干血片法替代血清學方法的可靠性和可行性。

1　資料與方法

1.1一般資料所有濾紙血片標本均于2008年3月—2013年6月采集自妊娠15～20孕周的單胎孕婦，共1260例，均來自于解放軍第150中心醫(yī)院就診病例。孕婦年齡21～39歲，平均29歲。確切孕周的確定，按末次月經(jīng)計算月經(jīng)正常（26～30 d/次）者，有疑問者通過B超確定孕周，所有參加該研究的孕婦均獲得知情同意。

1.2方法

1.2.1濾紙干血片的制備參考新生兒疾病篩查濾紙干血片的制備［1］。手指采血或靜脈采血時捎帶取2滴靜脈血，垂直滴加1～2滴（50～100 μl）于濾紙上，濾紙血片直徑＞8 mm，自然干燥，4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2儀器與試劑DXI800微粒子化學發(fā)光分析儀、血清AFP及β-hCG聯(lián)合檢測試劑盒均購自貝克曼公司，質(zhì)控液購自伯樂公司，3～6 mm打孔鉗，美國產(chǎn)S&S 903特種濾紙。

1.2.3血片中AFP及游離β-hCG的檢測用打孔器在濾紙干血片上打下直徑6 mm血片2片，放入干凈試管中，加入0.2 μl緩沖液，快速震蕩1 h。儀器上設(shè)置標準液位置及實驗項目，取6支樣品杯分別加入190 μl標準液放置儀器上進行定標，設(shè)置質(zhì)控液和樣本的編號及項目內(nèi)容，在樣品杯中加入190 μl血片洗脫液、190 μl質(zhì)控液。放置儀器上進行自動檢測。

1.2.4濾紙干血片方法的可行性評估

1.2.4.1精密度分別從15、17、20孕周的孕婦樣本中隨機各抽取1份濾紙干血片樣本，每份樣本重復(fù)12次，觀察每批日間變異。每天對這3份樣本進行常規(guī)檢測，連續(xù)20 d，觀察日內(nèi)變異。

1.2.4.2回收率取1份濾紙干血片浸出液標本，定值后分別加入AFP或β-hCG試劑盒中不同濃度的標準品，進行批試驗，每份標本重復(fù)測3次，求取均值。分別統(tǒng)計分析回收率?；厥章?（回收量/加入量）×100%。

1.2.4.3濾紙干血片與血清中濃度的相關(guān)性采用兩種不同的方法檢測AFP及β-hCG含量后，對結(jié)果做相關(guān)性分析。

1.2.4.4靈敏度為可檢測的最低檢測下限。采用正常男性血片（血液中AFP及β-hCG水平分別小于0.5 ng/L及0.5 mIu/ml）作為空白樣本，重復(fù)檢測空白及不同低濃度樣品20次，當某低濃度樣品的平均值-2SD低濃度樣品剛好大于空白樣品的平均值+2SD空白時，這一低濃度即為該方法的靈敏度［2］。1.2.4.5穩(wěn)定性隨機抽取了5例保存于2～8℃、-20℃以下，1周、2周、1個月及2個月的濾紙干血片標本，測定其AFP及β-hCG含量，并與采血當日的結(jié)果相比較（重復(fù)測定20次）。

1.2.4.6末梢血片與靜脈血片的相關(guān)性在常規(guī)實驗的條件下，分別測定20位孕中期婦女的兩種血片中AFP及β-hCG的水平，并對結(jié)果做相關(guān)回歸分析。

1.2.4.7紅細胞壓積的不同對血片中AFP及βhCG水平的影響抽取三組各孕周構(gòu)成比相同但紅細胞壓積不同的干血片標本（紅細胞壓積分別為≤0.3，0.3～0.4和＞0.4）。采用單因素方差分析，對三組AFP及β-hCG測定結(jié)果進行比較分析。

1.2.51260例孕婦血片與血清篩查結(jié)果的比較血片標本由中國人民解放軍第150中心醫(yī)院檢驗科采集制作，采用所建立的濾紙干血片檢測方法進行血片中AFP及β-hCG水平的檢測工作。采用全自動微粒子發(fā)光儀，嚴格遵照SOP標準程序進行操作，通過配套篩查軟件對Down’s綜合征發(fā)病風險進行評估，并與血清篩查結(jié)果相比較。同時評價分析兩種篩查方法的經(jīng)濟成本。

1.3統(tǒng)計學處理以SPSS13.0對計量資料、計數(shù)資料進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，采用t檢驗進行兩樣本比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1精密度以批內(nèi)及日間變異系數(shù)（CV）評價β-hCG及AFP的精密度，β-hCG、AFP的批內(nèi)、日間CV均＜10%，說明本法重復(fù)性好、精確度高。見表1、2。

表1　濾紙干血片法測定AFP、游離β-hCG的批內(nèi)變異（n=12）

表2　濾紙干血片法測定AFP、游離β-hCG的日間變異（n=20）

2.2回收率濾紙干血片法測定AFP及β-hCG的回收率為91.1%～101.6%和96.4%～99.5%。見表3。

2.3血清與血片中濃度的相關(guān)性血清與血片中AFP濃度呈高度相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.986 （P＜0.001）；血清與血片中β-hCG濃度呈高度相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.991（P＜0.001）。

2.4靈敏度β-hCG的最低檢測限為0.5 ng/ml，其重復(fù)檢測20次的微粒子發(fā)光讀數(shù)平均值2.6 （1673.8）-2SD（SD=128.1）＞空白平均值（1287.2）+ 2SD（SD=63.8）。AFP的最低檢測限為0.5 ng/ml，其重復(fù)檢測20次的微粒子發(fā)光讀數(shù)平均值（1700.8）-2SD（SD=132.3）＞空白平均值（1237）+2SD（SD= 70.7）。

2.5穩(wěn)定性5例保存于2～8℃、-20℃以下，1周、2周、1個月及2個月濾紙干血片標本的結(jié)果，與采血當日之結(jié)果相比較（重復(fù)測定20次），日間CV均在+3SD之內(nèi)，因此不同的保存溫度和保存時間的濃度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4、5。

表3　濾紙干血片法測定AFP、游離β-hCG的標本回收率

表4　濾紙干血片法測定AFP的日間變異（x±s，μg/ml）

表5　濾紙干血片法測定游離β-hCG的日間變異（x±s，ng/ml）

2.6靜脈血片與末梢血片濃度的相關(guān)性通過相關(guān)回歸分析顯示，兩種血片中的AFP及β-hCG值相關(guān)系數(shù)r分別0.992及0.991，兩種血片之間AFP 及β-hCG水平的差異無統(tǒng)計學意義。

2.7紅細胞壓積的不同對血片中AFP及β-hCG水平的影響采用單因素方差分析，對三組AFP及β-hCG測定結(jié)果進行比較分析，不同的紅細胞壓積對AFP和β-hCG濃度的影響差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表6。

表6　不同紅細胞壓積（Hct）的干血片標本中AFP、游離β-hCG含量的比較

2.81260例孕婦血片與血清篩查結(jié)果的比較采用血片法對1260例孕婦進行唐氏綜合征篩查，敏感度=66/（66+2）=97.1%，特異度=1230/（1230+16）= 99.0%，準確度=（69+1230）/1320=98.9%。依據(jù)以上指標，認為血片法測定孕婦AFP、β-hCG的水平，篩查唐氏綜合征靈敏度高、特異性強，成本低廉。

2.9濾紙干血片法的準確度為評價濾紙干片法的準確度，將1260例孕婦血片與血清篩查結(jié)果進行比較，前者陽性率為5.9%（74/1260），后者的陽性率為5.4%（68/1260），其中1例得以確診，篩查陽性率的差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.925，P＞0.05），見表7。

表7　濾紙干血片法與血清法唐氏綜合征篩查結(jié)果的比較

3　討論

微粒子化學發(fā)光方法（CLEIA），采用金鋼烷（AMPPD）標記抗原或抗體，在堿性磷酸酶作用下得到一個中等穩(wěn)定的中間體AMPD（半衰期2～30 min）。此中間體分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子，當其回到基態(tài)時產(chǎn)生470 nm的光，并可持續(xù)幾十分鐘，用化學發(fā)光的檢測技術(shù)檢測光子的量，計算出物質(zhì)的相應(yīng)濃度。極大地提高了分析的靈敏度、特異性、重復(fù)性、線性范圍，抗干擾能力、自動化程度及檢測速度，是目前國內(nèi)外檢測血清微量標記物常用的生物學技術(shù)。目前我國也逐步采用了微粒子發(fā)光這一先進技術(shù)，測定血清中AFP及游離β-hCG的含量，用于孕中期唐氏綜合征篩查，在一定程度上有取代ELISA的趨勢。

血片法最早在1963年由Guthrle等人首次用于代謝性疾病的大規(guī)模篩查，進而應(yīng)用于新生兒疾病的篩查［3］。濾紙干血片標本生物安全性高，具有標本運送安全、方便快捷且不增加篩查成本等優(yōu)點，更適合大規(guī)模篩查工作的開展。在以濾紙干血片為載體的標志物檢測方面，微粒子化學發(fā)光方法已用于測定血清中微量甲狀腺激素、苯丙酮含量［2］。目前，還鮮見運用微粒子化學發(fā)光方法濾紙干血片聯(lián)合檢測AFP及游離β-hCG的報道。因此，采用微粒子化學發(fā)光法比較分析濾紙干血片法與血清法的檢測效果，評價以濾紙干血片為載體的檢測方法在孕中期唐氏綜合征篩查中的應(yīng)用價值，具有重要的意義。

該研究在國內(nèi)較早以濾紙干血片作為載體［4］，采用微粒子化學發(fā)光方法檢測人血AFP及游離βhCG的水平，用于孕中期唐氏綜合征的篩查。首先評價了濾紙干血片法技術(shù)上的可行性。通過比較采用微粒子發(fā)光法分別檢測濾紙干血片及血清中的AFP及β-hCG含量的變異度、回收率、分析靈敏度，結(jié)果表明差異無統(tǒng)計學意義，符合美國CLIA’88規(guī)定的質(zhì)量要求標準。其次，評價了濾紙干血片法在保存方面的優(yōu)勢。國外已有報道顯示AFP和游離β-HCG血片在4℃時可保存60 d［5］，這樣便避免了篩查單位必需配備-20℃冰箱的要求，減少了篩查成本。不同紅細胞壓積對血片中分析物濃度的影響也成為血片法能否代替血清法的一個重要因素。該研究對1260個標本中隨機抽取三組不同紅細胞壓積的標本，進行了AFP及游離β-hCG含量的對比測定，經(jīng)統(tǒng)計學處理，結(jié)果較為一致。國內(nèi)少見采用微粒子發(fā)光法檢測干血片標本中AFP及游離βhCG，以及研究不同的紅細胞壓積對干血片標本唐氏綜合征篩查結(jié)果影響的報道。然后，對末梢血濾紙干血片與靜脈血濾紙干血片中AFP及游離βhCG濃度是否有明顯變化做了對比分析。結(jié)果顯示血片與血清中AFP和β-hCG含量無明顯差異，因此在制作血片時，可以根據(jù)篩查對象的意向，選擇用靜脈血或末梢血制作濾紙干血片標本。最后，評價了該方法對孕中期唐氏綜合征的篩查的臨床意義。孕周中位數(shù)值的計算受樣本量大小的影響，進而影響篩查的陽性率。該次研究結(jié)果顯示，當切值定為1/270時，濾紙干血片法測定AFP及游離βhCG篩查Down’s綜合征的陽性率為6.2%，稍高于金標準——血清篩查陽性率5.4%，經(jīng)統(tǒng)計學分析處理，兩者無明顯差異。血片和血清篩查結(jié)果與國際公認的金標準血清學篩查結(jié)果的符合率為98.9%，表明血片法可以代替血清法用于Down’s綜合征的產(chǎn)前篩查。

總之，采用微粒子發(fā)光方法檢測以濾紙干血片為載體的AFP及游離β-hCG的含量，具有檢測效率高以及樣品采集、運輸、保存方便等優(yōu)勢，對孕中期Down’s綜合征的產(chǎn)前篩查具有重要的臨床應(yīng)用價值。

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［本文編輯：吳蓉］

Feasibility of the dried blood spots specimen method used to screen prenatal Down’ssyndromeamong mid-term pregnant women

LIU Qing-yin①，LI Ya-ni，TU Bin，et al.①Clinical Labortary，No.150 Central Hospital of Chinese PLA，Luoyang，Henan 471000，China

ObjectiveTo explore the feasibility of the dried blood spots specimen methods used to screen prenatal Down’s syndrome among mid-term pregnant women.MethodsThe levels of serum Alpha-fetoprotein （AFP）and free beta-human chorionic gonadotropin（β-hCG）in dried blood specimen on filter paper were detected with the method of CLEIA.The variation coefficient，recovery rate and detection limit were estimated. The screening result of serum AFP and β-hCG in dried blood specimen on filter paper specimen methods was compared with that of routine serum methods.ResultsIn test AFP，the variation coefficient，recovery rate and detection limit was 2.1%-6.5%，96.2%and 0.5 ng/ml，respectively；in test β-hCG，the corresponding results was 3.9%-6.7%，98.4%and 0.5 ng/ml，respectively.The onset risk rate was 1/128，with an accordance rate of 98.89% compared with that of the gold standard of serum screening method which is universally accepted.A total of 1260 pregnant women were screned for prenatal Down＇s syndrome 74 were positive（5.9%）among whom one fetus was diagnosed as Down’s syndrome by detecting the chromosomes in the amniotic fluid.ConclusionThe method of CLEIA through dried blood spots specimen，substitutes for the routine serum method to detect the levels of AFP and β-hCG among mid-term pregnant women is convenient and feasible，and its screening result is accurate and reliable.

Dried blood specimen on filter paper；Down’s syndrome；Alpha-fetoprotein；Free beta-human chorionic gonadotropin

R714.5

A

471000河南洛陽，解放軍150醫(yī)院檢驗科（劉清銀，胡曉丹，劉小慶）；044500山西永濟，解放軍空軍永濟場站醫(yī)院（李婭妮）；471000河南洛陽，出入境檢驗檢疫局體檢科（涂斌）；河南省洛陽市第五人民醫(yī)院檢驗科（周玉杰）

李婭妮，qingyinliu@163.com