高堂珂綜述，薛衛(wèi)國審校

APPswe/PS1dE9 雙轉(zhuǎn)基因小鼠是目前阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)病理學(xué)實驗中常用的動物模型，該模型是Jankowsky 實驗室以AD 病理學(xué)理論中Aβ 級聯(lián)致病假說為基礎(chǔ)［1］，培育出能夠表達(dá)人類APP 和PS1 突變基因的轉(zhuǎn)基因鼠動物模型［2］，該模型可在一定程度上模擬AD 的病理特征和漸進(jìn)性的病程。近年來，許多使用APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的實驗中發(fā)現(xiàn)，小鼠腦內(nèi)Aβ 沉積量與其認(rèn)知功能減退并不成正比，小鼠腦內(nèi)Aβ 沉積量與其月齡變化關(guān)系也沒有較為統(tǒng)一的結(jié)論。因此實驗中往往需通過認(rèn)知行為學(xué)數(shù)據(jù)及Aβ 水平干預(yù)措施對進(jìn)行評價，再進(jìn)行綜合分析，這樣產(chǎn)生的誤差會影響實驗結(jié)果。故本文將結(jié)合目前的研究文獻(xiàn)對該雙轉(zhuǎn)基因鼠表型中的Aβ 病理與行為學(xué)是否存在可能的相關(guān)性及二者與小鼠月齡的變化關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 不同月齡APP/PS1 小鼠在行為學(xué)實驗中認(rèn)知功能的變化

目前用于APP/PS1 小鼠認(rèn)知能力的行為學(xué)實驗方式主要為迷宮實驗，迷宮實驗中常用的檢測裝置有Morris 水迷宮、多臂水迷宮、T-型迷宮、十字迷宮實驗等。實驗中，APP/PS1 小鼠出現(xiàn)認(rèn)知能力改變的月齡在不同迷宮實驗裝置中檢測結(jié)果會有所不同。

1.1 APP/PS1 小鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能改變的月齡 在上述多種迷宮裝置中，Morris 水迷宮是最常用的評價小鼠學(xué)習(xí)記憶水平的實驗裝置，主要的實驗方法為:定位航行試驗、空間探索試驗分別對轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)、空間記憶以及長時程記憶能力進(jìn)行檢測［3］，“逃避潛伏期”是應(yīng)用最廣泛的評價指標(biāo)。Jankowsky 的實驗團(tuán)隊在2005 年的研究表明，8 月齡APP/PS1 小鼠在Morris 水迷宮實驗裝置中已經(jīng)能夠檢測到認(rèn)知功能的改變［4］，而后的實驗中，發(fā)現(xiàn)雙轉(zhuǎn)基因小鼠可能于6～8 月齡在Morries 水迷宮中開始出現(xiàn)認(rèn)知功能改變［5］。而其他的迷宮實驗裝置，尚未能發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)行為學(xué)改變月齡的規(guī)律。如Xiong［6］等則發(fā)現(xiàn)6 月齡的雙轉(zhuǎn)基因鼠在多臂水迷宮中進(jìn)入錯誤臂的平均次數(shù)才開始明顯的多于野生鼠，但OLeary［7］在巴恩斯迷宮中檢測到16 月齡雙轉(zhuǎn)鼠才與野生鼠明顯的認(rèn)知功能區(qū)別。綜上所述，不同的實驗裝置檢測到雙轉(zhuǎn)鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能改變的月齡是不同的。即使是同一實驗裝置，可能由于小鼠個體間的差異或?qū)嶒灧椒ú僮鞯挠绊懀瑱z測結(jié)果也會有所不同。

1.2 隨著月齡的增加雙轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能的變化FAD 患者的認(rèn)知功能會隨著病程的延長而不斷下降。故用以模擬AD 病理規(guī)律的APP/PS1 雙轉(zhuǎn)小鼠在行為學(xué)實驗中的表現(xiàn)與月齡間也可能存在某種相關(guān)性，經(jīng)過對實驗文獻(xiàn)的總結(jié)，在不同的迷宮實驗裝置中月齡與認(rèn)知功能間的關(guān)系主要體現(xiàn)于兩個方面。一是隨著月齡的增加，雙轉(zhuǎn)基因鼠在迷宮實驗中認(rèn)知功能損害逐漸加重;二是與野生鼠相比，月齡越大的雙轉(zhuǎn)基因鼠在行為學(xué)實驗中學(xué)習(xí)記憶能力越差。在Morries 水迷宮實驗裝置中，大部分6～18 月齡區(qū)間的雙轉(zhuǎn)小鼠均可檢測到認(rèn)知能力呈逐漸下降的趨勢［8，9］。且低月齡(小于等于5月齡)雙轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比經(jīng)多次訓(xùn)練后，二者間逃避潛伏期下降趨勢差別很小。而(5 月齡以上)雙轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠同樣次數(shù)的訓(xùn)練后，其逃避潛伏期反映出明顯的學(xué)習(xí)記憶能力下降。在其他迷宮實驗裝置，雙轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比逃避潛伏期也反應(yīng)出相同的趨勢［10，11］。綜上所述，在應(yīng)用迷宮裝置的行為學(xué)實驗中，APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能與月齡間存在一定的規(guī)律，從實驗結(jié)果中可看出，隨著月齡的增加，與野生鼠相比APP/PS1 鼠的認(rèn)知功能受損程度在不斷加重，其學(xué)習(xí)記憶能力的損害可能最為明顯。

2 不同月齡小鼠腦內(nèi)Aβ 水平的情況

2.1 Aβ 沉積于APP/PS1 小鼠腦內(nèi)形成淀粉樣斑塊的實驗檢測 APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)模擬了Aβ 過量沉積，形成淀粉樣神經(jīng)炎性斑塊等人類AD 的病理變化。目前常用的APP/PS1 雙轉(zhuǎn)鼠模型Aβ 檢測指標(biāo)有，腦內(nèi)Aβ1-42和Aβ1-40、老年斑等。檢測Aβ 的實驗方法有ELISA 檢測法、硫磺素S(Thioflavin-S)熒光染色檢測法等，前者用于腦組織中的Aβ1-40及Aβ1-42的觀察，后者用于腦內(nèi)纖維性β-淀粉樣蛋白斑塊的檢測。Jankowsky 認(rèn)為APP/PS1 小鼠［12］約在6 月齡即可見腦內(nèi)淀粉樣斑塊沉積，18 月齡時沉積程度最為嚴(yán)重。如Garcia［13］使用體內(nèi)雙光子顯微鏡直接觀察到小鼠在6～7 月齡腦內(nèi)出現(xiàn)淀粉樣斑塊，并用硫磺素-S 熒光染色法示4 月齡小鼠腦內(nèi)僅有極少量可檢測的斑塊，斑塊負(fù)荷甚至接近0%，6 月齡時斑塊數(shù)量約80/ mm2，斑塊負(fù)荷約1.7%。且發(fā)現(xiàn)同一實驗中6 月齡鼠腦內(nèi)斑塊數(shù)量約為45 塊，8 月齡約為170 塊，12 月齡約為220 塊。平均斑塊面積和負(fù)荷也呈逐步上升趨勢。本實驗方法同樣可定位老年斑在小鼠腦內(nèi)的分布，在APP/PS1 小鼠皮質(zhì)和海馬中Aβ 淀粉樣沉積所形成的斑塊被染色后顯影最多。低月齡APP/PS1 小鼠腦內(nèi)Aβ水平與同月齡野生鼠基本相同，約在4 月齡少量沉積，但直到6～7 月齡才能用ELISA 法檢測到。所檢測的Aβ 沉積總量在雙轉(zhuǎn)基因鼠4～12 月齡內(nèi)應(yīng)呈逐漸增加的趨勢［14］由于Aβ 在APP/PS1 小鼠腦內(nèi)以多種形式存在，可以肯定不可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的總量在腦內(nèi)的沉積呈增長趨勢，但可溶性Aβ 量的變化則尚無定論。

2.2 Aβ1-40與Aβ1-42隨月齡比值的變化 APP/PS1 小鼠腦內(nèi)淀粉樣蛋白形成的速率與Aβ1-40∶ Aβ1-42的比率變化直接相關(guān)［15］。兩者中增加速度最快的可能與老年斑形成的相關(guān)性最大。由于不同實驗中ELISA 檢測采用的勻漿方法、試劑盒等實驗過程千差萬別，因此計算Aβ1-40與Aβ1-42的比值是驗證Aβ 致病性的最好方式。通常認(rèn)為6 月齡時Aβ1-40∶Aβ1-42通常約為0.75∶ 1。且隨著月齡的增加，Aβ1-40總量∶Aβ1-42總量的比值逐漸應(yīng)先增大后減小。綜上，APP/PS1 小鼠腦內(nèi)Aβ 沉積會隨著月齡的增加而加重，選擇6～7 月齡開始檢測APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠小鼠腦內(nèi)Aβ 沉積水平也許為最佳，但也有實驗者對此持相反意見，認(rèn)為3 月齡開始即可檢測到腦內(nèi)Aβ 沉積。一般認(rèn)為Aβ 沉積主要沉積與小鼠腦內(nèi)的皮質(zhì)顳側(cè)部與海馬［16］。Aβ1-42/1-40比值變化與月齡間可能沒有相關(guān)性，該比值可能為Aβ1-42的沉積獨立于Aβ1-40沉積的證據(jù)。同時也是判斷Aβ1-40和1-42致病性的最佳指標(biāo)。

3 小鼠腦內(nèi)Aβ 情況與認(rèn)知功能改變相關(guān)性評價

3.1 實驗的系統(tǒng)誤差影響認(rèn)知行為學(xué)及Aβ 水平數(shù)據(jù)系統(tǒng)誤差主要為性別、基因突變造成的表達(dá)差異、生長環(huán)境等因素。由于AD 發(fā)病除了年齡因素外，還有性別、基因突變、教育程度等因素的影響。對于APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，因此我們根據(jù)AD 的發(fā)病過程，期望小鼠能夠在“高齡”時先出現(xiàn)Aβ 過量沉積形成老年斑，再產(chǎn)生行為學(xué)改變(學(xué)習(xí)記憶能力下降，認(rèn)知功能損害)。但事實上，許多因素影響了APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因鼠在AD 病理學(xué)實驗中的表現(xiàn)。(1)性別，目前普遍認(rèn)為雄性APP/PS1 鼠在行為學(xué)檢測中出現(xiàn)認(rèn)知功能下降的月齡要晚于相同條件下飼養(yǎng)的雌性，雌性小鼠的Aβ1-40和1-42 水平以及出現(xiàn)的斑塊數(shù)量都要高于同月齡的雄性小鼠［17］。這可能是受到性激素的影響出現(xiàn)的結(jié)果。(2)小鼠傳代時的基因突變導(dǎo)致后代表達(dá)的差異。如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因(Bndf)，它的表達(dá)缺失會是造成APP/PS1 小鼠的過度肥胖，從而造成行為學(xué)檢測結(jié)果的誤差。并且可以肯定其對ELISA 檢測法的結(jié)果有著影響。(3)小鼠飼養(yǎng)環(huán)境的因素，2003 年Jankowsky 實驗室探索性的檢測了飼養(yǎng)環(huán)境因素對小鼠腦內(nèi)Aβ 沉積的影響，發(fā)現(xiàn)APP/PS1 小鼠在外界刺激豐富的環(huán)境下長大比在標(biāo)準(zhǔn)動物房飼養(yǎng)長大腦內(nèi)Aβ 的沉積量有很大區(qū)別。綜上，對于APP/PS1小鼠模型，存在多種外界及自身對實驗造成的系統(tǒng)誤差，這些誤差不可避免的要對小鼠的行為學(xué)檢測和腦內(nèi)Aβ 沉積過程造成影響。

3.2 從不同Aβ 致病理論的角度探究 Aβ 級聯(lián)假說作為AD 發(fā)病的主要假說，其并未完全闡明Aβ 如何造成認(rèn)知功能減退，因此學(xué)者們提出幾種假說以更深入闡明Aβ 導(dǎo)致認(rèn)知功能減退的機(jī)制。(1)實驗者們認(rèn)為這是由腦內(nèi)Aβ 的某種早期聚集形式導(dǎo)致，即“Aβ 寡聚體”。早期月齡Aβ 可溶性寡聚體早于Aβ 沉積形成板塊，產(chǎn)生神經(jīng)毒性影響突觸功能導(dǎo)致認(rèn)知功能下降。之后老年斑塊沉積大量出現(xiàn)，此時寡聚體和淀粉樣斑塊共同存在于腦內(nèi)，產(chǎn)生神經(jīng)毒性使主宰神經(jīng)認(rèn)知功能的神經(jīng)元、突觸的結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)一步損害。這也可以讓我們從病理學(xué)角度解釋為什么一些實驗中小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降發(fā)生早于Aβ 過量沉積形成老年斑。(2)APP/PS1 小鼠個體間行為學(xué)檢測結(jié)果的差異可能因?qū)W習(xí)記憶系統(tǒng)的不同方面對Aβ 沉積所產(chǎn)生毒性的敏感度不同。如情景記憶能力比空間參考記憶能力對Aβ1-42的變化更敏感，長期記憶能力則可能受到寡聚體的直接影響。(3)寡聚體誘發(fā)的小鼠早期認(rèn)知功能下降是可逆的，即當(dāng)飼養(yǎng)過程中小鼠受到外界環(huán)境的影響或?qū)嶒炚叩闹饔^行為對小鼠的行為學(xué)實驗進(jìn)行干預(yù)(如故意將模型組在離平臺遠(yuǎn)的位置入水)，可能導(dǎo)致認(rèn)知功能損害出現(xiàn)組間和組內(nèi)統(tǒng)計學(xué)差異。最后，大鼠的Morris 水迷宮任務(wù)是由海馬、紋狀體、丘腦、前腦以及小腦等多個腦區(qū)共同協(xié)調(diào)，任何腦區(qū)的損害或腦區(qū)間聯(lián)系的破壞都會影響這一功能的實現(xiàn)。多數(shù)以APP/PS1 小鼠模型實驗中，海馬內(nèi)Aβ 水平和老年斑密度遠(yuǎn)超過其他腦區(qū)，行為學(xué)實驗中長期記憶能力普遍有損害癥狀，這可能是與老年斑產(chǎn)生神經(jīng)毒性導(dǎo)致海馬內(nèi)神經(jīng)突觸損傷有關(guān)。綜上，Aβ 與小鼠認(rèn)知功能下降間的相關(guān)性仍然難以準(zhǔn)確得出結(jié)論。

4 小 結(jié)

APP/PS1 轉(zhuǎn)基因鼠動物模型成功模擬了AD 發(fā)病的某些方面，如行為學(xué)檢測中認(rèn)知功能隨月齡的增加而下降，腦內(nèi)Aβ 沉積隨著月齡的增長而加重。Aβ 可能是AD 神經(jīng)認(rèn)知功能損害的始發(fā)因子，啟動了神經(jīng)退行性變，所以APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠早期月齡的認(rèn)知功能改變與Aβ 水平存在相關(guān)但非線性關(guān)系。但小鼠腦內(nèi)存在多種形式的Aβ(腦間質(zhì)液和細(xì)胞內(nèi)的可溶性Aβ、纖維性Aβ、Aβ 寡聚體)。它們對認(rèn)知功能損害的大小及同步性尚不清楚。且神經(jīng)炎性斑塊中的Aβ 沉積可能是代謝的副產(chǎn)品，也許神經(jīng)炎性斑塊的程度和Aβ 水平不能用于神經(jīng)病理變化程度的評估。轉(zhuǎn)基因小鼠可用于AD 發(fā)病機(jī)制研究及療效評估研究。AD 發(fā)病與哪個腦區(qū)的哪種Aβ 相關(guān)尚需要進(jìn)一步深入研究;選取哪種Aβ 相關(guān)指標(biāo)也是療效評估的關(guān)鍵點。

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