王菁

摘要 建立了大菱鲆肌肉中羧甲基賴氨酸（CML）的氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）檢測方法。以大菱鲆為研究對象，選用三氯甲烷/丙酮對樣品進行脫脂，經(jīng)硼氫化鈉還原、蛋白水解、凈化、衍生化（酯化與?；┖?，進行GCMS選擇離子監(jiān)測（SIM）模式檢測。選取m/z 392為定量離子，m/z 392， 365， 333， 305為定性離子。結(jié)果表明，CML三氟乙酰甲酯化衍生物峰面積與濃度在1～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，方法檢出限為1 mg/kg， 定量限為5 mg/kg，3個加標(biāo)水平（10， 150和350 mg/kg） 下的平均回收率在100%～104%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<5%（n=5）。

關(guān)鍵詞[HTSS]羧甲基賴氨酸； 大菱鲆； 氣相色譜質(zhì)譜； 衍生化

1引言

晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycation endproducts， AGEs）是食品中蛋白、脂質(zhì)和核酸等組分在熱加工過程中發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)的產(chǎn)物[1]，其中羧甲基賴氨酸（Nεcarboxymethyllysine， CML）為主要標(biāo)志性產(chǎn)物[2]。研究表明，食品中AGEs與心腦血管疾病、腎臟疾病、糖尿病及其并發(fā)癥等慢性疾病有密切關(guān)系[3，4]。為更好地監(jiān)測其在食品中含量，建立靈敏可靠的檢測方法非常必要。

目前，關(guān)于食品中CML檢測方法有酶聯(lián)免疫法（ELISA）[1，5]、高效液相色譜法（HPLC） [6～8]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS）[9，10]等。ELISA法操作相對簡便，但假陽性率高，僅能得到CML相對值（kU/g）；HPLC法通過衍生化使CML具有熒光性并定量分析，但該具有熒光特性的衍生物不穩(wěn)定，導(dǎo)致結(jié)果偏差較大；LCMS具有良好的靈敏度，又避免了衍生化處理，但基質(zhì)干擾帶來的離子抑制效應(yīng)難以避免，且檢測成本昂貴 [11]。GCMS具有高靈敏度、高選擇性的優(yōu)勢，有望開發(fā)成有效的CML檢測方法。Amélie [12]等運用GCMS對食品中CML進行檢測，由于前處理、基質(zhì)差異等原因，雖成功檢測到奶粉等產(chǎn)品中的CML，但未檢測到鮭魚中的CML。目前，尚未見水產(chǎn)品中CML確證檢測方法的報道。本研究以海水魚中重要養(yǎng)殖品種大菱鲆為研究對象，利用GCMS測定魚肉中CML含量，定量限由150 μg/L[12]降到5 μg/L，為水產(chǎn)品中CML檢測提供了技術(shù)參考。

2實驗方法

2.1儀器、試劑與材料

羧甲基賴氨酸（CML，純度98%，加拿大TRC公司）；二氯甲烷（色譜純，美國ACS公司）；三氟乙酸酐（色譜純，純度99%，北京百靈威科技有限公司）；氯化亞砜（色譜純，純度≥99.5%，天津科密歐試劑公司）；甲醇（色譜純，美國TEDIA公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

大菱鲆購自青島南山水產(chǎn)市場，經(jīng)“三去”處理后，取背部肌肉絞碎，分裝后，置于Symbolm@@ 18℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2溶液配制

準(zhǔn)確稱取10.00 mg CML于10.00 mL超純水，混勻，制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，分裝后，于Symbolm@@ 18℃保存?zhèn)溆谩?/p>

配制6 mol/L HCl、0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH 9.2）、2 mol/L NaBH4（溶于0.1 mol/L NaOH）；取1.46 mL氯化亞砜緩慢加入100 mL甲醇中，制成衍生劑備用。

2.3樣品前處理

2.3.1脫脂準(zhǔn)確稱取200.0 mg樣品于50 mL離心管，加入20 mL脫脂液，混勻，于4℃以4000 r/min離心15 min，棄上清液；再加入20 mL脫脂液，重復(fù)上述離心操作，棄上清液后以氮氣吹干，得蛋白沉淀。本研究選取正己烷[13]、水甲醇三氯甲烷[12]、三氯甲烷丙酮[14]3種脫脂液進行比較。

2.3.2硼氫化鈉還原為避免樣品中羰基化合物等經(jīng)后續(xù)高溫蛋白水解進一步生成CML造成檢測結(jié)果偏大，向蛋白沉淀中添加2 mL硼酸鹽緩沖液和400 μL NaBH4溶液，混勻，于4℃反應(yīng)8 h[15]。

2.3.3蛋白水解將還原后的蛋白沉淀轉(zhuǎn)移至10 mL安瓿瓶中，加入8 mL 6 mol/L HCl，充入氮氣后封瓶，于110℃烘箱水解，得到蛋白水解液。

3.3GCMS分析結(jié)果

為了將目標(biāo)峰更好地辨別出來，采用程序升溫方法進行氣相色譜峰分離。在SCAN模式中（圖2a），因魚肉組織基質(zhì)復(fù)雜，目標(biāo)峰極易被復(fù)雜的干擾因素掩蓋，因此選用SIM模式對目標(biāo)化合物進行檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品在SCAN模式下得到的質(zhì)譜圖（圖3），選擇特征定量離子與定性離子（表2），得到的選擇離子流色譜圖（圖2b）無其它干擾峰，且峰型良好，信噪比顯著提高，利于目標(biāo)化合物CML準(zhǔn)確定量分析。

3.4方法評價

3.4.1線性范圍本方法采用外標(biāo)法定量。準(zhǔn)確稱取10.00 mg CML標(biāo)準(zhǔn)品于反應(yīng)瓶中，按2.3.5節(jié)充分衍生化后，最終溶于10.00 mL二氯甲烷，制成標(biāo)準(zhǔn)貯備液，分裝后置于

Symbolm@@ 18℃貯存?zhèn)溆?。使用前用二氯甲烷稀釋，配制?， 5， 60， 80， 100， 150和200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。GCMS測定，以CML三氟乙酰甲酯化衍生物的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（圖4）。結(jié)果表明，CML在濃度為1～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)>0.999。

3.4.2檢出限與定量限因大菱鲆肌肉中含有CML，所以通過稀釋樣品檢測液，測定信噪比（S/N），確定檢出限與定量限。

使用Agilent公司離線分析工作站軟件計算信噪比，選取RMS S/N作為譜圖信噪比參數(shù)[13]。當(dāng)樣品檢測液RMS S/N=3時，根據(jù)檢測液濃度得出CML檢出限為1 mg/kg；當(dāng)樣品檢測液RMS S/N=10時，根據(jù)檢測液濃度得出CML定量限為5 mg/kg。

3.4.3準(zhǔn)確度與精密度在樣品中加入適量CML標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，制成10， 150和350 mg/kg的加標(biāo)樣品，按照2.3和2.4節(jié)，以測得添加量和添加量之比計算回收率。每個添加水平做5組平行，根據(jù)得到的回收率計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），評價精密度。

不加標(biāo)大菱鲆肌肉樣品中約含有9.60 mg/kg的CML，選取10， 150和350 mg/kg作為加標(biāo)水平，進行添加回收實驗，每個添加水平做5組平行，數(shù)據(jù)見表3。結(jié)果表明，CML在3個添加水平下的平均回收率在100%～104%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<5%。結(jié)果說明，本方法檢測大菱鲆肌肉中CML的準(zhǔn)確度和精密度良好，符合生物樣品的檢測分析要求。

3.5樣品分析

為考察方法的適用性，使用本方法對市售即食水產(chǎn)品進行抽檢。檢測結(jié)果表明，所有即食水產(chǎn)品中均含有CML。其中CML在罐裝金槍魚中含量為（34.81±0.46） mg/kg，罐裝鯽魚中含量為（200.60±6.58） mg/kg，烤制魷魚絲中含量為（335.21±9.42） mg/kg。即食水產(chǎn)品中的CML含量遠(yuǎn)高于生鮮大菱鲆，因即食水產(chǎn)品中含有糖、油等調(diào)味品，且經(jīng)熱加工、高溫殺菌等處理過程，有利于非酶糖基化反應(yīng)的進行，進而生成更多CML。

4結(jié) 論

本研究選用三氯甲烷丙酮為脫脂液，經(jīng)NaBH4還原、蛋白水解后，對樣品進行衍生化，選用二氯甲烷為溶劑，采用SIM模式掃描，建立了大菱鲆肌肉中CML的GCMS檢測方法。與酶聯(lián)免疫方法相比，GCMS法避免了酶聯(lián)免疫法的假陽性，能夠更加準(zhǔn)確地對魚類肌肉中的CML進行定性和定量分析，靈敏度更高，檢測結(jié)果易與其它方法進行比較，是檢測大菱鲆肌肉中CML含量的較好方法。

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AbstractA method was developed to determine the content of Nεcarboxymethyllysine （CML） in the muscle tissues of turbot by gas chromatographymass spectrometric method. Turbot was selected as the research object， homogenized muscle tissue samples of turbot defatted by chloroform/acetone were pretreated followed by reduction， acid hydrolysis， purifying and derivatization （esterification and acylation）. The ion of m/z 392 was selected as quantitative ion and the ions of m/z 392， 365， 333， 305 were selected as qualitative ions in selected ion monitoring mode. The range of the linear calibration curve of CML derivative peak area and concentration extended from 1 μg/L to 200 μg/L. The limit of detection was 1 mg/kg and the limit of quantification was 5 mg/kg. The average recoveries ranged from 100% to 104% at 10， 150 and 350 mg/kg spiked levels and the relative standard deviation （RSD） was within 5% （n=5）.

《有機物絡(luò)合萃取化學(xué)》（第二版）

戴猷元、秦?zé)?、張瑾、單欣?編著

本書分原理和應(yīng)用兩部分，重點介紹了絡(luò)合萃取的化學(xué)原理、過程特征、萃取體系、分離工藝及模型預(yù)測、應(yīng)用實例及前景。在有機物絡(luò)合萃取機理分析和研究日趨深入的基礎(chǔ)上，本次對全書進行了系統(tǒng)地修訂，并重點對應(yīng)用實例部分進行了必要的補充。

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