王書珍等

摘要：采用簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性分子標(biāo)記（Inter -simple sequence repeat， ISSR）技術(shù)，對龜峰山3個野生杜鵑（Rhododendron simsii Planch.）居群共23個種質(zhì)材料進行了遺傳多樣性分析與評價。運用40條ISSR引物共篩選出7條擴增條帶清晰、重復(fù)性好和多態(tài)性高的引物；篩選出來的7條ISSR引物共擴增出79條清晰的條帶，其中多態(tài)性條帶有74條，平均多態(tài)性位點比率為93.67%，等位基因數(shù)Na和有效等位基因數(shù)Ne分別為1.962 0和1.555 4，奈氏基因多樣性指數(shù)h為0.330 8 ，香農(nóng)氏信息指數(shù)I為0.499 0，表明龜峰山古杜鵑群落具有較高的遺傳多樣性，其中Rho-M和Rho-H兩個居群之間的遺傳距離小至0.069 8，亦即這兩個居群之間的分化最小。試驗從分子層面對古杜鵑的遺傳多樣性分析將對龜峰山古杜鵑種質(zhì)資源的評價、保存以及杜鵑新品種的選育提供理論支撐。

關(guān)鍵詞：杜鵑（Rhododendron simsii Planch.）；簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性分子標(biāo)記；遺傳多樣性；種質(zhì)資源；龜峰山

中圖分類號：S685.21；Q503；Q16（634MC） 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）12-2931-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.031

Genetic Diversity Analysis of Ancient Rhododendron simsii from

the Guifeng Mountain by ISSR Markers

WANG Shu-zhen，ZHA San-sheng，F(xiàn)ANG Jiao，LI Zhi-liang，ZHANG Ming-ju，GAN Jian-ping，JIN Wei-bin

（Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resource Comprehensive Utilization/College of Chemistry and Life Science， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， Hubei， China）

Abstract： Genetic diversity of three wide rhododendron（Rhododendron simsii Planch.） populations （23 individuals in total） sampled from the Guifeng Mountain， was evaluated with Inter -simple sequence repeat （ISSR） markers. Among the 40 ISSR primers，7 could amplify clear and high polymorphic bands. Additionally， the polymorphic ISSR markers gave out 79 clear bands， and 74 of them were polymorphic， with a ratio of 93.67%. Simultaneously， the Na and Ne were 1.962 0 and 1.555 4， respectively；Neis gene diversity （h） and Shannons information index （I） were 0.330 8 and 0.499 0，respectively. Results showed that genetic diversity of Guifeng Mountain R. simsii population was high， and the genetic distance between populations Rho-M and Rho-H was just 0.069 8， as indicated the low genetic differentiation between populations. Therefore， this study will provide theoretical basis towards the future evaluation， preservation and breeding selection of R. simsii.

Key words：Rhododendron simsii Planch.；Inter-simple sequence repeat；genetic diversity； germplasm resources；Guifeng Mountain

杜鵑（Rhododendron simsii Planch.）被譽為“花中西施”和“木本花卉之王”，屬于杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron L.）木本植物，在亞洲、歐洲、北美洲等地廣泛分布[1，2]。中國約有571個杜鵑花品種，特有種（類型）多達400多個，并且在滇藏川交匯處的橫斷山脈是世界上杜鵑花的發(fā)源地和分布中心[3]。杜鵑兼有生態(tài)保護、園林觀賞、藥用植物、科學(xué)研究等多重功效，尤其是其水土保持功能突出，在山地生態(tài)系統(tǒng)的維持中舉足輕重[1]。位于湖北省麻城市龜峰山的杜鵑花灌叢因其面積大、結(jié)構(gòu)純、樹齡長而成為當(dāng)下頗具吸引力的風(fēng)景區(qū)，具有很高的景觀利用價值；而從長遠來看，杜鵑資源的保護和永續(xù)利用與大別山區(qū)域的社會經(jīng)濟發(fā)展大局緊密相關(guān)，并且其作為植物基因庫的科研價值和自然遺產(chǎn)價值更是不可估量。

遺傳多樣性是生物多樣性的核心，是物種適應(yīng)環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)和進化的內(nèi)在動力，也是保護生物學(xué)研究的重點所在。利用分子標(biāo)記技術(shù)可以快速、高效檢測物種的多樣性，以便更全面地評價種質(zhì)資源。簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性分子標(biāo)記（Inter -simple sequence repeat，ISSR）是建立在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）基礎(chǔ)上的一種新型的分子標(biāo)記方法，具有操作簡單、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、信息量大的優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、遺傳多樣性分析、分子生態(tài)學(xué)研究、植物品種鑒定等研究領(lǐng)域里[4-9]。試驗從分子水平層面探討了野生杜鵑種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系和遺傳多樣性，以期為龜峰山野生杜鵑種質(zhì)資源的綜合評價、保護和新品種選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

杜鵑花種質(zhì)資源于2013年8～12月采自湖北省麻城市龜峰山風(fēng)景區(qū)，3個居群分別采自不同的海拔區(qū)域，具體信息見表1。分別采集各居群的新鮮葉片后放入自封袋內(nèi)，并置于冰盒中帶回實驗室，于-80 °C冰箱里保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 杜鵑基因組DNA提取和ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立 在經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室內(nèi)將采集的新鮮無病蟲害杜鵑葉片洗凈、晾干，并依據(jù)前期研究（另文發(fā)表）結(jié)果選用3×CTAB法提取23份杜鵑樣本的DNA。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量后在紫外分光光度計下測定其濃度，并將DNA濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL。在前期研究中，我們從模板DNA量、ISSR引物濃度、dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度等5個因素在4個水平上進行了正交試驗，建立了適合杜鵑花的ISSR-PCR擴增體系，本試驗采用了這個擴增體系，所采用的20 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 60 ng，ISSR引物為0.60 μmol/L，Taq DNA聚合酶濃度30 U/mL，Mg2+濃度為0.6 mmol/L，dNTPs濃度0.50 μmol/L。

1.2.2 ISSR引物擴增 挑選1個杜鵑種質(zhì)材料的DNA，設(shè)置溫度梯度進行PCR擴增，以篩選每條ISSR引物的最適溫度。分別從3個居群內(nèi)各挑選出2個種質(zhì)材料，對40條ISSR引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）進行初步篩選。將初篩中擴增效率高且穩(wěn)定性強的引物對3個居群共23個杜鵑種質(zhì)材料分別進行二次擴增。PCR擴增程序為：94 °C預(yù)變性10 min；94 °C變性40 s，在最適退火溫度下退火40 s，72 °C延伸100 s，35個循環(huán)；最后在72 °C延伸10 min。

1.2.3 帶型統(tǒng)計和多樣性分析 利用5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測ISSR-PCR的擴增產(chǎn)物，根據(jù)DNA條帶在凝膠上出現(xiàn)的有、無進行統(tǒng)計，有條帶的記為1，無條帶的記為0，然后把數(shù)據(jù)輸入Microsft Office Excel 2007軟件內(nèi)保存。將數(shù)據(jù)輸入Popgene 32軟件內(nèi)，利用軟件自帶的公式對3個杜鵑居群的遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)Na、有效等位基因數(shù)Ne、奈氏基因多樣性指數(shù)h、香農(nóng)氏信息指數(shù)I、群體遺傳一致度、遺傳距離進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR體系的建立

試驗采用的20 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系擴增的部分結(jié)果見圖1，該圖是利用引物ISSR 21對部分杜鵑種質(zhì)材料的擴增結(jié)果，在試驗范圍內(nèi)具有一定的代表性。

2.2 ISSR引物擴增結(jié)果

利用40條ISSR引物對6個杜鵑種質(zhì)材料的DNA進行擴增，共篩選出16條可以穩(wěn)定擴增的引物。在二次擴增時，對23個杜鵑種質(zhì)材料的DNA進行篩選，共篩選出了7條擴增條帶清晰、重復(fù)性好和多態(tài)性高的引物，具體見表2。這7條引物每條能擴增出來的條帶為5～17條，以RhoW10擴增的條帶最少，僅擴增出5個條帶；而RhoW21引物在杜鵑基因組DNA內(nèi)的結(jié)合位點多達17個。

2.3 遺傳多樣性分析

將通過二次擴增篩選得到的7個引物對野生杜鵑3個居群23個種質(zhì)材料進行ISSR擴增，共得到79個條帶，其中多態(tài)性條帶有74條，多態(tài)性比率為93.67%（表2），DNA條帶的相對分子質(zhì)量分布在100～2 000 bp。

對野生杜鵑3個居群ISSR擴增產(chǎn)物進行遺傳多樣性分析，結(jié)果見表3。從表3可見，23個杜鵑種質(zhì)材料每個位點的等位基因數(shù)Na為1.658 2～1.848 1（因數(shù)據(jù)篇幅過大，文中省略；下同），平均為1.767 9；每個位點的有效等位基因數(shù)Ne為1.421 2～1.498 1，平均為1.468 2；每個位點的奈氏基因多樣性指數(shù)h為0.243 0～0.297 8，平均為0.275 1；每個位點的香農(nóng)氏信息指數(shù)I為0.360 7～0.448 0，平均為0.411 5。所采集的龜峰山杜鵑種質(zhì)資源在DNA分子水平上整體具有較高的遺傳多樣性，其整體奈氏遺傳多樣性指數(shù)h高達0.330 8，香農(nóng)氏信息指數(shù)I為0.499 0。并且樣品代表性較強，采樣地分布均勻，因此龜峰山野生杜鵑居群的整體多樣性較強。

在3個不同海拔高度的杜鵑群體內(nèi)，以低海拔的Rho-L群體的遺傳多樣性最高，其奈氏基因多樣性指數(shù)h高達0.297 8；遺傳多樣性最低的是高海拔的Rho-H群體，其奈氏基因多樣性指數(shù)h僅為0.243 0。說明隨著高度的增加，龜峰山野生杜鵑居群的遺傳多樣性有逐漸降低的趨勢。山頂?shù)貐^(qū)的遺傳退化和多樣性降低可能是環(huán)境因素引起的，龜峰山上的喬木資源比較少，作為灌木叢生長的野生杜鵑幾乎裸露，而且海拔越高其裸露程度越強，生存環(huán)境越惡劣，故此推測群落結(jié)構(gòu)簡單可能是導(dǎo)致其遺傳多樣性程度降低的主要原因之一。

2.4 遺傳相似性分析

利用Popgene 32軟件分析了3個杜鵑居群的遺傳相似性，結(jié)果見表4。從表4可見，居群Rho-M和Rho-H之間的遺傳距離最小，為0.069 8；而Rho-H與Rho-L之間的遺傳距離最大，高達0.152 1，即兩者之間的親緣關(guān)系最遠；Rho-M與Rho-L之間的遺傳距離居于中間。因此，龜峰山海拔1 091 m處的Rho-M群體和1 182 m處的Rho-H群體的杜鵑花資源其DNA相似度最高，在進化上更趨向于協(xié)同，可能的原因是兩個群體的海拔高度比較接近、生態(tài)環(huán)境較為相似造成的，說明景觀生態(tài)條件對杜鵑居群的影響較為相近。遺傳一致度的分析也證明了這一點。

3 討論

遺傳多樣性是物種長期進化的結(jié)果，遺傳多樣性越高，則種質(zhì)資源在DNA分子水平上存在的差異就越大，物種的適應(yīng)能力和抵抗環(huán)境選擇壓力的能力就越強，進化的潛力就越大，越有助于保護物種和整個生態(tài)系統(tǒng)的多樣性，并且可供進一步選擇、保存和利用的潛力就越大[10，11]。北熱帶中低海拔區(qū)的龜峰山（115°08E-115°18E，31°03N-31°07N，主峰海拔1 320 m）位于鄂豫皖三省交界處的湖北省麻城市。因漫山遍野的杜鵑花（主要為映山紅亞屬，Rhododendron subgen. Tsutsusi）被中國花卉協(xié)會命名為“中國映山紅第一城”，當(dāng)?shù)噩F(xiàn)在已將杜鵑花資源優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢，大力營造濃厚的杜鵑花氛圍，在推動杜鵑花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的同時帶動了地區(qū)旅游業(yè)及周邊地區(qū)花卉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展；“人間四月天，麻城看杜鵑”的國家級旅游品牌已經(jīng)成功叫響，并且極大地促進了地方經(jīng)濟的發(fā)展。因此，對龜峰山野生杜鵑資源的遺傳多樣性評估也就顯得尤為重要[12]。

ISSR分子標(biāo)記多次被用于研究杜鵑居群的遺傳多樣性。金則新等[13]利用12對ISSR引物對浙江省內(nèi)的5個云錦杜鵑（R. fortunei Lindl.）自然居群的遺傳多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)云錦杜鵑物種水平的遺傳多樣性很高，而居群水平的遺傳多樣性較低；并認(rèn)為居群隔離、自交衰退可能是導(dǎo)致云錦杜鵑居群間遺傳分化的主要原因。劉旭穎等[14]用13個ISSR標(biāo)記對遼寧省的9種耐寒杜鵑花親緣關(guān)系進行了分析并構(gòu)建了系統(tǒng)樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記分類結(jié)果與與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果基本一致。趙芯等[15]用12個ISSR引物對浙江大明山4個麂角杜鵑（R. latoucheae Franch.）種群的遺傳多樣性和遺傳分化進行分析，發(fā)現(xiàn)麂角杜鵑種群的遺傳多樣性較高，其奈氏遺傳多樣性指數(shù)h為 0.309 9，香農(nóng)氏信息指數(shù)I為 0.464 0。趙凱等[16]用8個ISSR 標(biāo)記對5個都支杜鵑（R. shanii Fang）居群擴增后發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點比率為52.17%，物種水平的香農(nóng)氏信息指數(shù)I為 0.253 6，奈氏遺傳多樣性指數(shù)h為0.165 9，奈氏基因分化系數(shù)GST=0.184 5，基因流Nm=2. 210 4，并推測較強的基因流、多年生木本及異交與分布區(qū)狹窄等是導(dǎo)致都支杜鵑遺傳多樣性較低的主要原因。劉雁飛等[17]利用ISSR分子標(biāo)記研究了長白山北坡4個不同海拔高度的牛皮杜鵑（R. chrysanthum Pall.）自然居群的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，揭示出該物種具有較高的遺傳多樣性水平，且隨著海拔梯度由低到高而增大；并認(rèn)為除了繁殖策略之外，長白山當(dāng)?shù)氐牡乩憝h(huán)境對牛皮杜鵑居群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的塑造起到了重要作用。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)龜峰山杜鵑居群整體水平上具有較豐富的遺傳多樣性，但隨著海拔的增高，其遺傳多樣性有逐漸降低的趨勢，這可能與龜峰山山頂?shù)貐^(qū)幾乎無喬木遮蓋的生態(tài)環(huán)境有關(guān)。因此我們認(rèn)為龜峰山山頂?shù)貐^(qū)的杜鵑居群存在著較高的遺傳風(fēng)險，在后期的保護實施中更應(yīng)該重點關(guān)注山頂?shù)貐^(qū)的野生杜鵑居群。本研究利用ISSR標(biāo)記在分子水平上揭示了龜峰山野生杜鵑資源的種群結(jié)構(gòu)，這將為龜峰山古杜鵑種質(zhì)資源的評價、保存以及杜鵑新品種的選育提供理論支撐。

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