郭宏儒　（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院　通遼　028043）　任秀珍?。▋?nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院）曹貴方?。▋?nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物胚胎與發(fā)育生物學(xué)研究室　內(nèi)蒙古 呼和浩特）

試驗(yàn)研究

蒙古綿羊Bcl-2基因5′端cDNA的克隆及序列分析

郭宏儒（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院通遼028043）任秀珍（內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院）
曹貴方*（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物胚胎與發(fā)育生物學(xué)研究室內(nèi)蒙古 呼和浩特）

摘要為擴(kuò)增蒙古綿羊bcl-2基因5′端，根據(jù)GenBank上已公布的牛的序列，設(shè)計了2條引物。從蒙古綿羊脾中提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出bcl-2的cDNA，并重組到pBlueselectT載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶譜分析和DNA序列測定，測出5′RACE產(chǎn)物434個核苷酸序列，該序列包括C端144個氨基酸編碼序列、翻譯起始密碼子ATG。

關(guān)鍵詞綿羊Bcl-2基因克隆5′RACEcDNA中圖分類號：S826.8+2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-1733（2015）02-0001-02

Bcl-2基因（即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一種原癌基因，近年的研究證明它具有抑制凋亡的作用。1972年Kerr［1］首先提出了細(xì)胞凋亡的概念。細(xì)胞凋亡（apoptosis）與生物學(xué)和醫(yī)學(xué)關(guān)系密切，是現(xiàn)代科研領(lǐng)域中重大課題與研究熱點(diǎn)之一。1980年Wyllie［2］發(fā)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶激活引起凋亡細(xì)胞DNA特異性梯形帶（ladder pattern）的形成，引起了發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、分子生物學(xué)、腫瘤學(xué)等研究工作者的廣泛興趣，并重新引起了世界范圍內(nèi)對細(xì)胞凋亡研究的熱潮［3］。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)對象及組織蒙古綿羊取自于內(nèi)蒙古穆斯林屠宰場。取新鮮脾臟液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2藥品與試劑瓊脂糖、溴乙錠、總RNA提取試劑盒（Cat.NO.Z5110）購自Promega公司。反轉(zhuǎn)錄RT-PCR試劑盒（Cat.NO.DRR019A）、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、5′RACE試劑盒（Cat.NO.D315）、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和XbaⅠ、T4連接酶、TaKaRa ExTaq DNA Polymerase、DNA Marker為DL2000（分子量為2000、1000、750、500、250、100）、PMD18-T載體；質(zhì)粒提試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；E.coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3PCR引物的設(shè)計與合成（1）根據(jù)GeneBank反芻動物Bcl-2的基因序列，利用計算機(jī)軟件DNAStar進(jìn)行基因序列的同源比較得出Bcl-2 cDNA序列的保守區(qū)，根據(jù)該cDNA保守區(qū)和引物設(shè)計原則涉及兩對PCR引物，Bcl-2：上游引物（P1），下游引物（P2）。上游引物（P1）：5′-TTCGCCGAGATGTCCAGTC-3′，下游引物（P2）：5′-ATCCCAGCCTCCGTTGTCC-3′。（2）5′RACE用引物：根據(jù)已獲得蒙古綿羊Bcl-2 cDNA的已知序列設(shè)計兩條反義引物P3、P4，正義引物為TaKaRa 5′RACE試劑盒提供。引物由上海生物工程公司合成。5′RACE Outer Primer: 5′-CAT GGC TAC ATG CTG ACA GCC TA-3′，P5：5′-ATG CCT TTG TGG AGC TGT ATG -3′，5′RACE InnerPrimer：5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTC GATG -3′，P6：5′-TTG ATT TCT CCT GGC TGT CTC -3′。

1.4蒙古綿羊脾組織總RNA的提取采用Promega公司的總RNA提取試劑盒，按其說明進(jìn)行。最后用無RNA酶去離子水溶解RNA沉淀，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5利用RT-PCR方法克隆Bcl-2的中間片斷（1）cDNA第一條連的合成：提取蒙古綿羊脾組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組分總體系為10μl：總RNA4.5μl、10×RT buffer 1μl、MgCl2（25mM）2μl、dNTP Mixture（10mM）1μl、RNase Inhibiter（40U/μl）0.25μl、AMV Reverse Transcriptase Xl（5U/μl）0.5μl、 OligdT（2.5μmol/l）0.5μl、 RNase Free dH2O 0.25μl。反應(yīng)條件為：30℃10min、42℃30min、95℃5min、5℃5min，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用作PCR模版。（2）PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)組分總體系為50μl：RT溶液10μl、5×PCR Buffer 10μl、TaKaRa ExTaq（5U/μl）0.25μl、 P1（10pmol/μl）1μl、 P2（10pmol/μl）1μl、dH2O 27.75μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃3min、94℃30s、61℃30s、72℃45s，35個循環(huán)。（3）5′RACE產(chǎn)物的克隆、篩選及鑒定：按PCR產(chǎn)物純化試劑盒先將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化，然后用T4連接酶將純化的bcl-2 基因cDNA片斷與PMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109 感受態(tài)細(xì)胞后，在含X-gal、IPTG的LB平板培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)14h。選擇白色菌落，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)Hind Ⅲ和Xba Ⅰ對質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。

1.65′RACE PCR循環(huán)（1）cDNA第一條連的合成：將上述提取的RNA按照5′RACE試劑盒說明處理后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為10μl：Ligated RNA 6μl、Random 9 mers（50μM）0.5μl、5×M-MLV Buffer 2μl、dNTP 1μl、RNase Inhibiter（40U/μl）0.25μl、Reverse Transcriptase MMLV（200U/μl）0.25μl。反應(yīng)條件為：30℃10min、42℃1rh、70℃15min，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用作PCR模版。（22）套式PPCCRR：套式PPCCRR共進(jìn)行22次PPCCRR反應(yīng)。OOuutteerr PPCCRR反應(yīng)：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液22μll、11×ccDDNNAADDiilluuttiioonnBBuuffffeerrIIII 88μll、55×PPCCRRBBuuffffeerr44μll、MMggCCll22（2255mmMM）33μll、TTaaKKaaRRaa EExxTTaaqq（55UU//μll）00..2255μll、PP33（1100μMM）22μll、PP44（1100μMM）22μll、ddHH22OO 2288..7755μll。總反應(yīng)體系為5500μll。PPCCRR反應(yīng)條件為：9944℃33mmiinn、9944℃3300ss、5555℃3300ss、7722℃4455ss、7722℃11mmiinn，3355個循環(huán)。IInnnneerrPPCCRR反應(yīng)：OOuutteerrPPCCRR反應(yīng)液11μll、55×PPCCRRBBuuffffeerr 55μll、MMggCCll22（2255mmMM）55μll、ddNNTTPPMMiixxttuurree（22..55mmMM）88μll、TTaaKKaaRRaaEExxTTaaqq（55UU//μll）00..55μll、PP55（1100μMM）22μll、PP66（1100μMM）22μll、ddHH22OO2266..55μll?？偡磻?yīng)體系為5500μll。PPCCRR反應(yīng)條件為：9944℃33mmiinn、9944℃3300ss、5577℃3300ss、7722℃4455ss、7722℃11mmiinn，3355個循環(huán)。（44）DDNNAA序列測定：將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR的擴(kuò)增（1）對蒙古綿羊各組織器官Bcl-2進(jìn)行表達(dá)檢測，根據(jù)對其設(shè)計的引物，以脾組織的總RNA為模版，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，將其純化產(chǎn)物直接送上海生工生物工程公司進(jìn)行DNA序列測定161bp，經(jīng)過網(wǎng)上BCBI BLAST序列比對，證明確實(shí)是Bcl-2基因表達(dá)（圖1）。（2）Bcl-2中間片斷的克隆及重組質(zhì)粒的篩選和鑒定：對RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T Vector載體（2962bp）連接后獲得陽性隆，提取質(zhì)粒DNA后用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindⅢ分別酶切鑒定，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳（90V，1.0h）檢測，得到一個約161bp的片斷，與預(yù)期的片段大小相符，證明已插入PMD18-T載體，并命名為重組載體PMD18-T-Bcl-2（見圖2）。

2.1RT-PCR的擴(kuò)增（1）對蒙古綿羊各組織器官Bcl-2進(jìn)行表達(dá)檢測，根據(jù)對其設(shè)計的引物，以脾組織的總RNA為模版，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，將其純化產(chǎn)物直接送上海生工生物工程公司進(jìn)行DNA序列測定161bp，經(jīng)過網(wǎng)上BCBI BLAST序列比對，證明確實(shí)是Bcl-2基因表達(dá)（圖1）。（2）Bcl-2中間片斷的克隆及重組質(zhì)粒的篩選和鑒定：對RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T Vector載體（2962bp）連接后獲得陽性隆，提取質(zhì)粒DNA后用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindⅢ分別酶切鑒定，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳（90V，1.0h）檢測，得到一個約161bp的片斷，與預(yù)期的片段大小相符，證明已插入PMD18-T載體，并命名為重組載體PMD18-T-Bcl-2（見圖2）。

圖1　M. DL2000 DNA Marker 1. Bcl-2 cDNA RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2　重組質(zhì)粒 PMD18-T- bcl-2限制性酶切分析

2.25′RACE的擴(kuò)增（1）套式PCR：經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，5′RACE產(chǎn)物大小為434bp（見圖3）。（2）5′RACE產(chǎn)物的克隆、篩選及鑒定：將5′RACE反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物與pBlueselect T載體連接篩選后獲得陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA后經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切鑒定，證實(shí)含有插入的目的片段（見圖4）。（2）5′RACE產(chǎn)物的序列分析 經(jīng)酶切鑒定正確的質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。5′RACE產(chǎn)物測出434個核苷酸序列，該序列包括C端144個氨基酸編碼序列、翻譯起始密碼子ATG（見圖5）。

圖3　bcl-2 cDNA RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖4　重組質(zhì)粒 PMD18-T- bcl-2限制性酶切分析

圖5　Bcl-2 cDNA核苷酸序列

3　討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞由基因控制的有序的死亡，又稱為程序性的細(xì)胞死亡（PCD）。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡過程中的一類調(diào)節(jié)因子［4］。已有大量的研究提示，此蛋白家族需定位于線粒體膜才能發(fā)揮調(diào)節(jié)凋亡的作用。Bcl-2家族蛋白包括兩類功能相反的蛋白質(zhì)，一類是抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等；另一類是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白Bax、Bak、Bok等。Bcl-2相關(guān)蛋白包含不同數(shù)量Bcl-2保守區(qū)域（BH12BH4）。本研究通過套式-PCR技術(shù)成功成功地擴(kuò)增獲得了綿羊Bcl-2基因的5′RACE序列，5′RACE產(chǎn)物測出434個核苷酸序列，該序列包括C端144個氨基酸編碼序列、翻譯起始密碼子ATG 。這為Bcl-2基因全序列的測定奠定了基礎(chǔ)，同時也能更好的了解和掌握Bcl-2家族蛋白的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制，從而為更好地治療腫瘤疾病打下良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］ Kerr JFR， Wyllie AH， et al. A histochemical study of hypertrophy and ischaemic injury of rat liver with special reference to changes in lysosome. ［J］Path Bact， 1965， 90（2）:419.

［2］ Wyllie AH. Glucocorticoid-induced tgymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. ［J］Nature， 1980， 284:555-556.

［3］ 張洪波， 曹貴方. 細(xì)胞凋亡調(diào)控基因［J］. 畜牧與飼料科學(xué)， 2004，2:49-50.

［4］ 張勤麗. 細(xì)胞凋亡機(jī)制概述［J］. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)， 2007， 24 （1）:105-106.

收稿日期：（2014-12-02）

*通訊作者