周進(jìn)文

(黑龍江省大西江農(nóng)場(chǎng)畜牧科,黑龍江黑河 161448)

奶牛腸道致病性沙門氏菌的分離與鑒定

周進(jìn)文

(黑龍江省大西江農(nóng)場(chǎng)畜牧科,黑龍江黑河 161448)

奶牛沙門氏菌病是指奶牛受到沙門氏菌屬細(xì)菌所感染而導(dǎo)致奶牛受到傳染而發(fā)生疾病。常見的奶牛受到沙門氏菌感染后所引起的癥狀有:奶牛敗血癥、奶牛胃腸炎以及懷孕母牛發(fā)生流產(chǎn)等等。本試驗(yàn)為調(diào)查研究黑龍江省九三管理局某牛場(chǎng)沙門氏菌的流行情況,對(duì)黑龍江省九三管理局某奶牛場(chǎng)出現(xiàn)疑似癥狀的奶牛進(jìn)行采取腸道新鮮糞便進(jìn)行了致病性沙門氏菌的分離與鑒定。

奶牛沙門氏菌病;沙門氏菌屬細(xì)菌;分離

1 材料與方法

1.1 材料

糞樣：取自黑龍江省九三管理局某奶牛場(chǎng)疑似感染沙門氏菌的荷斯坦泌乳奶牛的直腸糞便。

培養(yǎng)基：DHL 瓊脂、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、SS 瓊脂、三糖鐵培養(yǎng)基。

革蘭氏染色試劑：草酸銨結(jié)晶紫染色液；革蘭氏碘液；沙黃水溶液；碳酸品紅溶液。

1.2 方法

糞樣的采集：從試驗(yàn)牛的肛門采集直腸糞樣，將采集的新鮮糞樣分別裝入無(wú)菌三角瓶立即送實(shí)驗(yàn)室。

致病菌培養(yǎng)：

預(yù)增菌培養(yǎng)：無(wú)菌稱取樣品 25.0g，加入蛋白胨水225ml，于37℃培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng)18 h。

選擇性增菌培養(yǎng)：取預(yù)增菌0.1ml，接種含有 10 ml MeCl2—MM的培養(yǎng)管當(dāng)中，培養(yǎng)溫度設(shè)置為42 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為 24 h；另外選取預(yù)增菌培養(yǎng)物 10ml，接種于含有 100ml SC培養(yǎng)管當(dāng)中，于37℃培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng) 1～2d。

純化培養(yǎng)：?。∕M）和（SC）增菌液，分別劃線接種于DHL 瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng) 18h～24h，選取單克隆菌種，純化培養(yǎng)。純化的可疑菌落接種普通瓊脂斜面，置于37℃培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng) 18 ～24 h，于4℃冰箱當(dāng)中保存?zhèn)溆谩?/p>

致病菌的鑒定：

鏡檢：從 DHL 瓊脂平皿培養(yǎng)物上挑取單個(gè)可疑菌落，涂片、革蘭氏染色，鏡檢。

生化鑒定：純培養(yǎng)后的菌株接種于普通肉湯中 37℃培養(yǎng)18h～24 h 后，吸取 1～2 滴的肉湯培養(yǎng)物加入各種微量生化管內(nèi)，37℃培養(yǎng) 24h～48h，觀察結(jié)果。

血清型鑒定：采用玻片凝集法。在玻片上用少量生理鹽水稀釋普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的純化菌落至懸液呈均勻的乳白色，首先滴加 1 滴沙門氏菌 A－F 多價(jià)血清與之混合均勻，觀察結(jié)果；然后，用各群 O 抗原因子血清，即 O2（A 群）、O4（B 群）、O7（C1 亞群）、O8（C1 亞群）、O9（D4 群）、O5，O10（E群）、O11（F 群）對(duì)被檢菌逐個(gè)進(jìn)行凝集試驗(yàn)檢查，確定其 O抗原組成。同時(shí)，以標(biāo)菌株做陽(yáng)性對(duì)照、滅菌生理鹽水代替多價(jià)血清做陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離細(xì)菌培養(yǎng)特性

分離的細(xì)菌于37℃培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用普通營(yíng)養(yǎng)肉湯時(shí)，出現(xiàn)渾濁且有少量的沉淀出現(xiàn)。

于常規(guī)普通的營(yíng)養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)勢(shì)良好，菌種形態(tài)為：略微凸起、表面光滑、呈圓形；顏色為：半透明，或者呈現(xiàn)出灰白色；菌種之間排列較為緊密，而且大小均勻。

將分離的菌株培養(yǎng)于 SS 瓊脂后發(fā)現(xiàn)，菌落形態(tài)為：菌落性狀均一，呈圓形狀態(tài)，略微凸起，菌落中央呈現(xiàn)出黑色

將分離得到的菌種培養(yǎng)于 DHL 瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：菌落狀態(tài)為：無(wú)色半透明，產(chǎn)生H2S菌落的中心呈現(xiàn)為黑色；而乳糖呈現(xiàn)陽(yáng)性的菌株的顏色呈現(xiàn)為：粉紅色，且?guī)в泻谏?；將其進(jìn)一步接種 TSI 斜面，產(chǎn)生如表 1結(jié)果的菌落判為疑似菌，傳代純化后進(jìn)一步做生化鑒定和血清型鑒定。

表1 沙門氏菌三糖鐵（TSl）培養(yǎng)基生長(zhǎng)判斷標(biāo)準(zhǔn)

2.2 形態(tài)學(xué)特性

涂片、革蘭氏染色鏡檢為兩端鈍圓、革蘭氏陰性短小桿菌。如圖1

圖1 沙門氏菌革蘭氏染色

2.3 生化鑒定結(jié)果

將分離得到的菌株置于生化管當(dāng)中于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為 1～2 d，觀察，并記錄結(jié)果。三糖鐵斜面的顏色為紅色，底部呈黃色略變黑。沙門氏生化鑒定結(jié)果：H2S、丙二酸鹽為大多數(shù)菌株陽(yáng)性/少數(shù)陰性；靛基質(zhì)、尿素、KCN、水楊素、吲哚、ONPG為陰性；賴氨酸脫羧酶、山梨醇、甘露醇、衛(wèi)矛醇、木糖、硝酸鹽、葡萄糖、枸櫞酸鹽均為陽(yáng)性；

2.4 血清型鑒定

所采取樣品進(jìn)行培養(yǎng)之后的培養(yǎng)液與用于鑒定的血清在2分鐘內(nèi)發(fā)生凝集即為陽(yáng)性，相反則為陰性。各群中 B 群沙門氏菌最為普遍，占 50.0%（4/8），其次為 D 群沙門氏菌、C1 群沙門氏菌、A 群沙門氏菌，各占 12.5%（1/8）、25%（2/8）、12.5%（1/8）

3 討論

對(duì)疑似沙門氏菌的菌種進(jìn)行血清型鑒定實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在同一個(gè)牛場(chǎng)當(dāng)中所感染的沙門氏菌得血清型就有多種，說(shuō)明沙門氏菌血清型的復(fù)雜性。此外，對(duì)沙門氏菌研究較為普遍的報(bào)道一般以牛流產(chǎn)沙門氏菌的分離鑒定為主。因此，調(diào)查該地區(qū)牛場(chǎng)當(dāng)中沙門氏菌的血清型以及流行情況，不但為牛場(chǎng)沙門氏菌病的防制，提供了理論基礎(chǔ)以及科學(xué)依據(jù)，此外該措施無(wú)疑將為控制沙門氏菌污染食品奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)對(duì)疑似感染沙門氏菌的奶牛進(jìn)行采樣分析，對(duì)其直腸內(nèi)糞便內(nèi)菌群進(jìn)行分離鑒定，對(duì)所分離出的菌種的形態(tài)特征、染色結(jié)果、培養(yǎng)特性、三糖鐵瓊脂板上的生長(zhǎng)形態(tài)特征，從九三管局某牛場(chǎng)當(dāng)中出現(xiàn)疑似感染沙門氏菌共 4 頭成年泌乳荷斯坦奶牛直腸新鮮糞便中初步分離到 4 株沙門氏菌。通過(guò)觀察這幾株菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)、生化試驗(yàn)、血清型鑒定等試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，4 株沙門氏菌為致病性沙門氏菌，其血清型有A 群、B 群、C1亞群、D4 群。而奶牛在受到沙門氏菌感染時(shí)，主要的致病性沙門氏菌為鼠傷寒沙門氏菌以及都柏林沙門氏桿菌。奶牛在被沙門氏菌所感染之后通常表現(xiàn)出胃腸炎、敗血癥、懷孕母牛發(fā)生流產(chǎn)等癥狀。為此，在畜牧業(yè)的生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)牛舌環(huán)境質(zhì)量的控制無(wú)疑將成為首要任務(wù)，同時(shí)更應(yīng)該要高度注意奶牛的環(huán)境衛(wèi)生，并采用綜合性疾病防治措施，此舉，無(wú)疑對(duì)保障畜牧業(yè)的發(fā)展以及畜牧經(jīng)濟(jì)動(dòng)物健康具有重要的意義。

[1] 吳美云.奶牛腸道沙門氏菌的分離鑒定、對(duì)機(jī)體內(nèi)分泌的影響和體外抑制研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.