暴國，王尚明，張長勇，魏剛，陳西華，王麗麗，張斌，許芮豪，王寧，石翠格，徐祥波，賀斌，王介東，張樹成

（國家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081）

目前已經(jīng)建立的生精障礙動物模型各具特點(diǎn)，常以外源性因素對動物機(jī)體造成損傷而獲得生精障礙，但機(jī)體的其他組織和器官也同樣會發(fā)生異常。外源性因素包括物理（如溫水浴、紅外線、激光、微波和超聲波等熱效應(yīng)，冷效應(yīng)，電離輻射的多種射線等）、化學(xué)（如化療藥物環(huán)磷酰胺、白消安，腎損害藥物腺嘌呤，直接破壞生精功能的藥物棉酚、雷公藤）和病理（通過實(shí)驗(yàn)對動物造成免疫性生精功能損害，如實(shí)驗(yàn)性抗精子抗體、實(shí)驗(yàn)性睪丸炎、實(shí)驗(yàn)性隱睪、實(shí)驗(yàn)性精索靜脈曲張）以及基因缺陷／轉(zhuǎn)基因動物的動物模型。造模成功的動物成為少精子癥、無精子癥、弱精子癥模型動物［1］。白消安清除內(nèi)源性生精細(xì)胞誘導(dǎo)無精子癥模型是生精障礙造模方法中常用的經(jīng)典方法之一。

白消安是氮芥類烷化劑。在體內(nèi)主要作用于G1期和G0期的細(xì)胞，是細(xì)胞周期非特異性藥物，通過與細(xì)胞DNA 中鳥嘌呤發(fā)生烷化作用而破壞DNA 的結(jié)構(gòu)與功能［2-3］，嚴(yán)重干擾DNA 的合成，具有特異性地?fù)p傷干細(xì)胞的作用。

不同白消安劑量造成生精上皮不同程度的損害，小鼠無精子癥造模文獻(xiàn)報告所建議的使用劑量是采用腹腔單次注射白消安40 mg／kg 以上［4-5］。本實(shí)驗(yàn)室在工作中發(fā)現(xiàn)白消安劑量對不同品系動物造模效果存有差異，造模中動物的死亡率與白消安劑量直接相關(guān)，而過高的動物死亡率直接增加實(shí)驗(yàn)成本。本文報告3個品系小鼠（NIH、ICR、Balb／c）不同劑量白消安的造模效果，比較優(yōu)化最佳實(shí)驗(yàn)臨界劑量，以期減少動物的死亡率、提高造模成功的實(shí)驗(yàn)效率。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物及造模方法

SPF級成年雄性小鼠在屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，光周期調(diào)控為06：00～18：00光照，18：00～06：00黑暗；溫度控制21±2℃，濕度控制50%～60%，自由進(jìn)食和攝水。

分別使用ICR、NIH、Balb／c雄性小鼠（來源于中國生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動物中心、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心、北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司和中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心）4批次實(shí)驗(yàn)共1 096只。動物購入后飼養(yǎng)檢疫2周以上備用。所有動物隨機(jī)分組，腹腔單次注射白消安（mg／kg）45、40、35 和30 劑量，40d后存活小鼠為模型動物，造模后連續(xù)分別觀察2生精周期（小鼠生精周期為35～40d）共70d；以正常動物（無處理）為對照。

二、主要試劑

白消安（Sigam，美國，批號STBB7150V）溶解于 二 甲 基 亞 砜（DMSO；Amresco，美 國，批 號0939B379）中，于37℃水浴中保持恒溫配制成2%藥液［4］；DMEM／F12培養(yǎng)液（Wisent，加拿大，批號319080002）。

三、研究方法

1.實(shí)驗(yàn)方法：分4批次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每周稱量一次動物體重，比較動物體重。造模后每天觀察記錄動物生長和死亡情況。模型動物（給予白消安后40d的存活動物）分別于0.5周和5周、7.5周（分別為造模后和恢復(fù)1、1.5個生精周期）各取材3～5只動物，于10周（2個生精周期）觀察結(jié)束時取材全部動物。采用頸椎脫臼法處死后取材，進(jìn)行附睪精子檢測和睪丸組織形態(tài)觀察。

2.附睪精子質(zhì)量檢測：采用附睪精子泳動試驗(yàn)進(jìn)行精子質(zhì)量的檢測。每次實(shí)驗(yàn)前1天，對使用的培養(yǎng)液進(jìn)行毒性檢驗(yàn)（精子于該培養(yǎng)液中孵育1～2h觀察精子活動性）。將附睪于含2 ml培養(yǎng)液的35mm 培養(yǎng)皿中剪碎，36.5℃孵育30min使精子充分游離泳動，取精子游離懸液滴于載玻璃片上，鏡檢。觀察200個精子分析精子活動性指標(biāo)；使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行精子計(jì)數(shù)，分析精子數(shù)目指標(biāo)。

3.睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察：睪丸以多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm 切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，封片，鏡檢觀察。

4.造模和生精能力恢復(fù)效果的評價：本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的白消安生精障礙模型，以附睪精子質(zhì)量檢測和睪丸組織形態(tài)進(jìn)行評價，附睪中不能檢出精子或只能偶爾檢出不完整死精子和睪丸組織生精上皮損傷嚴(yán)重喪失生精能力為造模成功。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Excel保存，使用SPSS12.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用卡方檢驗(yàn)、回歸分析和方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、動物外觀體征表現(xiàn)

總體表現(xiàn)：造模后動物整體表現(xiàn)為明顯虛弱，體重開始減輕或不增加，明顯怕冷基本上迭擁擠靠在一起，脫毛明顯，出現(xiàn)乏力蜷臥、食量減少、活動明顯減少萎靡、反應(yīng)遲鈍、耳廓蒼白、瞇眼、眼瞼周圍浮腫、皮毛卷曲、豎毛皺綹、皮毛無光澤、多尿等癥狀。這些癥狀在3 個品系動物中表現(xiàn)一致，至造模后90d左右，以上癥狀開始好轉(zhuǎn)，但至實(shí)驗(yàn)全程仍無法達(dá)到正常動物的外觀體征表現(xiàn)（圖1、圖2）。

3個品系小鼠表現(xiàn)的比較：造模后NIH 與ICR、Balb／c小鼠的外觀體征表現(xiàn)明顯不同。造模產(chǎn)生的不良體征表現(xiàn)，在NIH 小鼠表現(xiàn)更為明顯，攻擊性明顯增加，撕咬爭斗加劇并連續(xù)，使皮毛產(chǎn)生的明顯外傷不易恢復(fù)；皮膚干燥且脆弱、口腔粘膜干燥和唇裂、皮膚潰爛、多形性紅斑和結(jié)節(jié)性紅斑等典型的骨髓再生障礙表現(xiàn)；而ICR 和Balb／c小鼠上述表現(xiàn)輕微。提示白消安對NIH 小鼠產(chǎn)生的損傷更明顯、更劇烈，受到的損傷恢復(fù)最慢。

二、造模動物死亡率

造模后第2天開始出現(xiàn)動物死亡，集中出現(xiàn)于2～3周，30d后減少，40d后基本無死亡（表1）。

3個品系小鼠的死亡率與白消安的劑量呈正相關(guān)。在NIH 小鼠，造模后死亡率呈顯著劑量效應(yīng)關(guān)系（P＜0.01），45mg／kg劑量組死亡率為69.2%，使造模成功動物明顯減少，造模效率低（圖3）。NIH 和ICR 小鼠35mg／kg劑量組的存活率分別為71.3%（194／272）和94.4% （51／54），顯 著 高 于40mg／kg劑量組（P＜0.01）；Balb／c小鼠35mg／kg劑量組存活率為90.9%，同期正常對照組動物存活率96.91%。

三、造模效果的比較分析

1.附睪精子檢查：對造模動物于自然恢復(fù)不同時間進(jìn)行附睪精子檢查顯示，30mg／kg白消安劑量組于0.5 周可見活精子，5 周可見大量活精子；35mg／kg白消 安 以 上3 個 劑 量 組 于0.5 周、5 周、7.5周附睪精子均為0（0.5周可偶見殘余不完整死精子）。

自然恢復(fù)10周（2個生精周期）檢查，結(jié)果顯示自然恢復(fù)能力NIH 小鼠顯著高于ICR、Balb／c小鼠（P＜0.01），Balb／c小鼠自然恢復(fù)能力最低僅可偶見不完整精子；自然恢復(fù)10周后，NIH 和ICR 模型小鼠均顯示白消安高劑量組（40或45mg／kg）精子質(zhì)量高于低劑量組（35mg／kg）的趨勢（表2）。

圖1 造模后40dNIH 小鼠外觀體征

圖2 造模后149dNIH 小鼠外觀體征

表1 造模動物死亡率

表2 造模動物自然恢復(fù)10周的附睪精子檢測結(jié)果

圖3 NIH 小鼠白消安不同劑量下的死亡率

2.睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察：造模動物自然恢復(fù)不同時間的睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察顯示，30mg／kg白消安劑量組于0.5周睪丸生精小管內(nèi)可見2～4層生精上皮，存在各級完整的生精細(xì)胞，顯示生精能力未受到完全損傷。35mg／kg白消安以上3個劑量組0.5周、5周生精上皮處于完全損傷狀態(tài)，僅殘余單層生精上皮細(xì)胞，生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少，基底膜側(cè)僅見少量精原細(xì)胞殘留，大部分細(xì)胞空泡化，變性細(xì)胞充斥管腔；7.5周可見生精上皮有散在的生精細(xì)胞，未見精子；10周可見生精上皮部分功能恢復(fù)，見有完整生精細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子；提示1.5個生精周期前處于無精子癥狀態(tài)，至2個生精周期生精能力輕度恢復(fù)。

3.造模效果和生精能力恢復(fù)的比較：通過附睪精子檢測和睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察，表明30 mg／kg白消安在NIH 小鼠造模失??；3 個品系小鼠在35mg／kg白消安以上3個劑量組造模成功，獲得無精子癥模型動物。使用臨界劑量35mg／kg可以取得較好造模效果，提示可以不采用通常建議的40mg／kg～45mg／kg劑量。白消安無精子癥小鼠模型在2個生精周期內(nèi)維持基本穩(wěn)定，處于無精子癥或低生精能力狀態(tài)，適合進(jìn)行相關(guān)研究工作，造模后的模型動物用于設(shè)計(jì)評價性試驗(yàn)時可以進(jìn)行70d（2個生精周期）的干預(yù)處理。

四、35mg／kg白消安無精子癥模型小鼠的生長表現(xiàn)和睪丸組織形態(tài)學(xué)鑒定分析

1.體重變化：3 個品系小鼠注射白消安后第2天動物體重即開始下降，造模后2周達(dá)到最低，以后逐漸緩慢增加，但始終低于正常動物，僅與造模前接近，說明造模后動物體重停止明顯生長。NIH 小鼠體重下降最明顯，下降22.15%（37.97g至29.56g）；ICR 小鼠下降8.14%（39.21g至36.02g），Balb／c小鼠下降10.82%（23.67g至21.11g）（圖4）。

2.睪丸組織形態(tài)學(xué)分析：（1）造模后：對35mg／kg白消安造模40d后的睪丸組織形態(tài)進(jìn)行觀察，顯示3 個品系小鼠的整體表現(xiàn)一致（圖5）。整個睪丸組織嚴(yán)重萎縮，極度退化變性，精曲小管萎縮變細(xì)疏松，管腔內(nèi)各級生精細(xì)胞呈明顯的空泡化，基底膜側(cè)精原細(xì)胞偶見，精曲小管內(nèi)未見精子；間質(zhì)組織發(fā)生退化，細(xì)胞形態(tài)不完整，排列紊亂，總體表現(xiàn)完全喪失生精生成能力（圖6）。（2）自然恢復(fù)2個生精周期：可見部分（約5%～15%）的精曲小管恢復(fù)生精上皮細(xì)胞，基底膜側(cè)可見散在精原細(xì)胞，整體表現(xiàn)仍為精子生成能力低下（圖7）。組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與附睪精子質(zhì)量檢測結(jié)果一致，造模后動物喪失精子發(fā)生能力，恢復(fù)2個生精周期后，部分精曲小管中可有部分生精上皮細(xì)胞恢復(fù)，恢復(fù)程度不一致，整體恢復(fù)表現(xiàn)為處于較低下程度。

圖4 造模后動物生長中的體重變化

圖5 造模40d 各品系小鼠睪丸組織橫切面（×20）

討 論

白消安（Busulfan，又名馬利蘭-Myleran，化學(xué)名1，4—丁二醇二甲磺酸酯）臨床上最初在1952年用于治療慢性粒細(xì)胞性白血?。?］，用于造血干細(xì)胞移植前清除體內(nèi)異常和腫瘤細(xì)胞、抑制／破壞受體免疫系統(tǒng)做好移植前的準(zhǔn)備工作［7-8］。具有特異性地?fù)p傷干細(xì)胞的作用。使用的劑量為半數(shù)致死量，在損傷生精干細(xì)胞的同時，也對其他組織干細(xì)胞產(chǎn)生損傷，產(chǎn)生較嚴(yán)重的骨髓抑制［4］。在注射后小鼠體重減輕，第二天開始出現(xiàn)死亡，一般3 周后不再死亡，存活小鼠體重明顯降低15%～25%，造模成功的存活小鼠在4周后血象開始恢復(fù)正常，而睪丸明顯萎縮，生精上皮產(chǎn)生直接損害，生精小管失去正常的生精上皮結(jié)構(gòu)［9］；小鼠的無精子癥表現(xiàn)是可逆的。

圖6 造模40d睪丸組織形態(tài)表現(xiàn)（×40）

圖7 造模后恢復(fù)2個生精周期的睪丸組織形態(tài)表現(xiàn)

白消安對睪丸生精能力產(chǎn)生直接損傷，主要通過氧化損傷抑制阻斷正常的精子發(fā)生，在特異性清除內(nèi)源性生精干細(xì)胞的同時，對間質(zhì)細(xì)胞無明顯毒性作用，睪丸生精小管呈唯支持細(xì)胞樣表現(xiàn)，3個月后可有20%的生精小管恢復(fù)生精［9］，這與本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果不一致，本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)白消安對睪丸間質(zhì)細(xì)胞有一定的影響，間質(zhì)組織發(fā)生退化，細(xì)胞形態(tài)不完整，推測原因可能是由于生精上皮的損傷嚴(yán)重，誘導(dǎo)了間質(zhì)細(xì)胞的變性退化，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；對睪丸支持細(xì)胞（Sertoli cell）之間的細(xì)胞連接也產(chǎn)生明顯損傷［10-12］。由于對DNA 合成的損害，所以體內(nèi)多種細(xì)胞的分裂生長均受到干擾，特別是處于快速分裂狀態(tài)的各級生精上皮細(xì)胞，均同時受到殺傷，使睪丸精子發(fā)生“即刻”發(fā)生阻滯。那么，“即刻”死亡的生精細(xì)胞和已有的精子，需要多長時間被清除出體內(nèi)，是解釋利用白消安模型的重要問題。研究顯示，白消安注射后4周，絕大部分各級生精細(xì)胞可以排出睪丸喪失生育能力，而前3周仍具有生育能力［10］。本實(shí)驗(yàn)通過3品系小鼠的35mg／kg白消安研究結(jié)果證實(shí)造模40d后，通過組織形態(tài)學(xué)評價睪丸內(nèi)生精上皮細(xì)胞基本清除“干凈”，附睪精子泳動試驗(yàn)證實(shí)附睪中無殘余精子，可利用造模成功的無精子癥模型動物（造模40d后存活動物）進(jìn)行藥效學(xué)研究。

白消安常用劑量在不同種屬的單位使用劑量差別很大，大鼠10mg／kg和15mg／kg［13-14］，豬40mg／kg～100 mg／kg［15］，狼只需4 mg／kg～12 mg／kg［16］。小鼠是使用最多的實(shí)驗(yàn)動物之一，以往主張的劑量多在40mg／kg～45mg／kg［4-5，9，17-20］。

由于白消安對機(jī)體細(xì)胞同時具有全身性的傷害，選擇最低有效劑量十分重要。有研究證實(shí)，在Balb／c小鼠，白消安在20 mg／kg以下不會導(dǎo)致動物死亡，在30mg／kg、40mg／kg、50mg／kg的死亡率分別為6.5%、86.7%、100%［21］。本實(shí)驗(yàn)觀察顯示，35mg／kg白消安造模后NIH 與ICR、Balb／c動物的體重變化明顯不同，白消安致NIH 小鼠體重降低程度最高，下降22.15%（37.97g至29.56g），體重恢復(fù)最慢；而ICR 和Balb／c小鼠表現(xiàn)基本接近，ICR 小鼠下降8.14%（39.21g至36.02g），Balb／c小鼠下降10.82%（23.67g 至21.11g）。NIH 和ICR 小鼠均顯示出模型小鼠在自然恢復(fù)10周后，高劑量組（40或45mg／kg）精子質(zhì)量有高于低劑量組（35mg／kg）的趨勢，提示白消安造模高劑量下死亡率高而存活動物可能生存質(zhì)量更高，生精恢復(fù)能力更強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在白消安35 mg／kg劑量下三個品系小鼠均可成功獲得無精子癥模型，動物死亡率在ICR 小 鼠 為5.6%、Balb／c 小 鼠 為9.1%、NIH 小 鼠 為30% 左 右（3 批 次 分 別 為31.2%、27.2%、29.6%），三品系小鼠在造模后動物外觀體征、死亡率（存活率）、體重方面具有明顯差異，白消安對NIH 小鼠產(chǎn)生的損傷更明顯，受到的損傷恢復(fù)最慢，ICR 和Balb／c小鼠表現(xiàn)基本接近。造模對動物的損傷（外觀體征、死亡率、體重）表現(xiàn)與精子質(zhì)量的恢復(fù)無明顯相關(guān)性（NIH 受到損害程度最高，但精液質(zhì)量的恢復(fù)以NIH 小鼠最高）；精液質(zhì)量的恢復(fù)與小鼠品系無直接關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：臨界劑量為35 mg／kg的白消安均可以對ICR、NIH、Balb／c三個品系雄性小鼠成功建立無精子癥模型，并較40mg／kg和45mg／kg白消安明顯降低動物死亡率，造模成功動物成活率明顯提高，提示可以不采用通常建議的40～45mg／kg劑量。白消安無精子癥小鼠模型在2 個生精周期（70d）內(nèi)維持基本穩(wěn)定，睪丸精子生成能力的恢復(fù)和附睪精子質(zhì)量均維持無精子癥或低生精能力狀態(tài)。

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