郎婧雯，孫貽娟，谷瑞環(huán)，馮云＊

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 200025；2.上海集愛(ài)遺傳與不育診療中心，上海 200011）

配子和胚胎冷凍技術(shù)是生育力保存和輔助生殖領(lǐng)域的重要組成部分，其中卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)的成功應(yīng)用不僅對(duì)人類(lèi)輔助生育技術(shù)的完善和發(fā)展有重要意義，對(duì)核移植工程［1］和珍稀物種生殖資源［2］的保存亦有重要推進(jìn)作用。卵母細(xì)胞因其體積大、含水量多、核無(wú)核膜包繞保護(hù)、膜的滲透性低等特點(diǎn)，使其成為最難成功冷凍的細(xì)胞類(lèi)型，凍融過(guò)程和玻璃化冷凍保護(hù)劑本身均會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)及附屬結(jié)構(gòu)（如透明帶、紡錘體、細(xì)胞骨架等）帶來(lái)一定損傷，進(jìn)而影響復(fù)蘇率、體外受精后的受精率及早期胚胎發(fā)育潛能［3］。國(guó)內(nèi)外在卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)領(lǐng)域的研究多集中于比較兩種冷凍方法（程序化慢速冷凍及玻璃化冷凍）或不同冷凍載體的冷凍效率、冷凍復(fù)蘇體系的建立和改進(jìn)等方面［4］，針對(duì)冷凍技術(shù)對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生影響的具體機(jī)制如基因表達(dá)、表觀遺傳修飾等方面則研究較少。卵母細(xì)胞特異性發(fā)育相關(guān)基因是一類(lèi)卵母細(xì)胞內(nèi)特有的、參與卵泡生成與成熟、受精與早期胚胎發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵基因［5］。而目前國(guó)內(nèi)外將這類(lèi)基因表達(dá)結(jié)合玻璃化冷凍技術(shù)的研究很少。本實(shí)驗(yàn)將成熟期（MII）卵母細(xì)胞分別行冷凍-復(fù)蘇液處理和玻璃化冷凍-復(fù)蘇，與新鮮MII卵母細(xì)胞比較體外受精后早期胚胎發(fā)育情況及卵母細(xì)胞特異性發(fā)育相關(guān)基因H1foo、Bmp15、Gdf9、Sohlh2、Nobox表達(dá)水平，探索玻璃化冷凍-復(fù)蘇液毒性及冷凍-復(fù)蘇技術(shù)對(duì)小鼠成熟期卵母細(xì)胞體外受精后早期胚胎發(fā)育潛能及卵母細(xì)胞特異性發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響。

材料和方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)性成熟期健康C57BL／6小鼠，雌性5～6周齡，體重16～18g；雄性3～4月齡，體重大于29g。由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院動(dòng)物房提供并飼養(yǎng)，自由攝食飲水，光照12h／d，飼養(yǎng)條件符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。

2.主要試劑：蔗糖、二甲亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）購(gòu)自Sigma公司，HTF、mHTF、CSC、SSS胚胎培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Irvine.Sci公司，孕馬血清促性腺激素（PMSG）購(gòu)自寧波第二激素廠，人絨毛膜促性腺激素（HCG）購(gòu)自杭州動(dòng)物藥品廠，F(xiàn)astQuant RT Kit（with gDNase）購(gòu)自天根生化科技有限公司，Sybr green（SYBR Select Master Mix）購(gòu)自美國(guó)Applied biosystems Inc公司。

二、方法

1.小鼠超排卵與取卵：雌性5～6 周齡小鼠腹腔注射PMSG 10IU，48h 后腹腔注射HCG 10IU，13～14h后頸椎脫臼處死，剖腹取出膨大的輸卵管壺腹部至預(yù)熱37 ℃的mHTF（10%SSS）滴中，迅速用5 號(hào)針頭撿出卵母細(xì)胞黏液團(tuán)，透明質(zhì)酸酶脫去顆粒細(xì)胞后，挑選已釋放第一極體的成熟期卵母細(xì)胞，并隨機(jī)分為三組：新鮮-復(fù)蘇液處理組，玻璃化冷凍復(fù)蘇組及新鮮-對(duì)照組。新鮮-對(duì)照組卵母細(xì)胞于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h，備用。

2.玻璃化冷凍：（1）玻璃化冷凍-復(fù)蘇液的配制：以mHTF（10%SSS）為基礎(chǔ)液配制冷凍液（V）及復(fù) 蘇 液（T）。平 衡 液（ES）：7.5%EG＋7.5%DMSO；冷 凍 液（VS）：15%EG ＋15%DMSO ＋0.5mol／L蔗糖；復(fù)蘇液WS1：1mol／L 蔗糖；WS2：0.5mol／L 蔗糖；WS3：0.25 mol／L 蔗糖；WS4：?jiǎn)渭兓A(chǔ)液。（2）新鮮-復(fù)蘇液處理組：每一次將5～7枚卵母細(xì)胞移入ES微滴（室溫）中，平衡6～8min待細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)后移入VS微滴，并在60s內(nèi)兩次置換VS微滴以快速滲透平衡，后直接將卵母細(xì)胞置入預(yù)熱37 ℃的WS1 微滴平衡1 min，按WS2、WS3、WS4順序分別平衡3min。將冷凍-復(fù)蘇液處理后的卵母細(xì)胞移回HTF 微滴，棄去未能存活的卵母細(xì)胞，余置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，備用。（3）玻璃化冷凍-復(fù)蘇組：按上述方法將本組卵母細(xì)胞通過(guò)ES、VS后迅速將含有卵母細(xì)胞的液滴吹至冷凍載體cryotop頂端薄膜上，迅速投入液氮。從卵母細(xì)胞置入VS液至投入液氮的時(shí)間控制在60s內(nèi)。復(fù)蘇時(shí)，將載體迅速?gòu)囊旱心贸?，即刻將薄膜頂端浸入預(yù)熱37 ℃的WS1 中1 min，此后步驟如前所述。

3.體外受精-胚胎培養(yǎng)：（1）精子采集和體外獲能：雄鼠頸椎脫臼處死，取附睪末端組織放入已平衡HTF（10%SSS）微滴中，擠壓附睪尾以釋放精子團(tuán)，取適量精子團(tuán)移入另一平衡后油封HTF（10%SSS）微滴中，37 ℃、5%CO2獲能1～1.5h。（2）體外受精和胚胎培養(yǎng)：吸取獲能液外層移入卵母細(xì)胞培養(yǎng)滴中進(jìn)行體外受精，濃度調(diào)整至（3～4）×106／ml，8h后將受精后卵母細(xì)胞移出，HTF 液置換兩次洗脫顆粒細(xì)胞及外周精子，將受精卵移至平衡后的HTF（10%SSS）微滴中培養(yǎng)。受精后24h觀察2-細(xì)胞出現(xiàn)情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)育至2-細(xì)胞胚胎占進(jìn)行受精的卵母細(xì)胞比例。并將胚胎移入平衡后的CSC（10%SSS）微滴中。受精96h 后觀察囊胚出現(xiàn)情況，計(jì)算各組發(fā)育至囊胚階段胚胎占已卵裂胚胎的百分比作為囊胚率。

4.卵母細(xì)胞特異性基因的mRNA 表達(dá)測(cè)定：RNA 抽提及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)均在專(zhuān)用PCR 實(shí)驗(yàn)室完成，冰上操作，并盡量縮短操作時(shí)間。（1）總RNA的提?。篗II期卵母細(xì)胞以5枚為一組進(jìn)行一次反應(yīng)，采用Zymo公司生產(chǎn)的Quick-RNA Microprep試劑盒，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行總RNA 提取。RNA 沉 淀 物 在 室 溫 下 干 燥6 min 后 用0.01%DEPC水溶解，取部分樣品經(jīng)紫外分光光度儀檢測(cè)RNA 含量和純度，OD260／OD280應(yīng)大于1.80。（2）cDNA 的 制 備：按 照FastQuant RT Kit 試 劑 盒（TIANGEN 公司）說(shuō)明書(shū)步驟將抽提RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。（3）PCR 引物設(shè)計(jì)及合成：引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法［6］，以β-actin為內(nèi)參，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列見(jiàn)表1。（4）實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real—time RT-PCR）：以全轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增cDNA 2μl、稀釋至2.5 mmol／L 的引物1.5μl、SYBR?Green PCR Master Mix（ABI公司）5μl、H2O 1.5μl構(gòu)建10μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣本的每個(gè)基因PCR 反應(yīng)均設(shè)置副孔，將上樣后的384 孔板置于PCR 儀（7900HT Fast Real Time PCR system，ABI）內(nèi)，反應(yīng)條件為95℃10min，95℃15s，60℃60s40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，完成溶解曲線圖。（5）實(shí)時(shí)熒光定量分析：采用相對(duì)定量法進(jìn)行分析。以每樣本內(nèi)參β-Actin Ct值為參照，每待測(cè)基因計(jì)算相對(duì)Ct值：△Ct待測(cè)＝Ct待測(cè)—Ctactin，以2-△Ct待測(cè)為統(tǒng)計(jì)量比較組間差異。Western-blot測(cè)定蛋白表達(dá)：將每組50枚MII期卵母細(xì)胞快速移入30μlRIPA 中裂解，每管樣品加入10μl 4×SDS裂解液，100 ℃水浴煮沸4-5min，-20 ℃保存。蛋白采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在80V、5%積層膠中電泳30 min，進(jìn)入12%分離膠后，120V 電泳90min，100V 恒壓電轉(zhuǎn)移1.5h至硝酸纖維膜（NC）上，電轉(zhuǎn)后將NC 膜置于含5%脫脂奶粉的TBST 中，室溫封閉2h。將膜在TBST 中洗滌3 遍，每遍5 min。將兔抗鼠多克 隆 抗 體Anti-H1foo antibody（sc-99918，Santa Cruz，INC）以1∶500 比 例 稀 釋 于 含5%BSA 的TBST 中，與NC 膜在4 ℃共孵育過(guò)夜。將過(guò)夜后的NC 膜與1∶2000 稀釋后的山羊抗兔熒光二抗（LI-COR，美國(guó)）室溫下共孵育1h。TBST 洗滌3遍后，應(yīng)用Odyssey蛋白電泳掃膜儀（LI-COR，美國(guó)）進(jìn)行掃膜。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料行方差分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、三組MII卵母細(xì)胞體外受精后2-細(xì)胞率及囊胚率的比較

應(yīng)用冷凍-復(fù)蘇液處理后的卵母細(xì)胞體外受精后，其2-細(xì)胞率（卵裂率）與囊胚率分別為77.42%及56.25%，與新鮮-對(duì)照組2-細(xì)胞率（81.25%）及囊胚率（57.7%）相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而玻璃化冷凍復(fù)蘇組的卵母細(xì)胞體外受精后，其2-細(xì)胞率（63.93%）較新鮮-對(duì)照組及新鮮-復(fù)蘇液處理組均顯著下降（P＜0.05），而囊胚率（53.84%）較新鮮-對(duì)照組及新鮮-復(fù)蘇液處理組有下降趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表1 基因名稱(chēng)、引物序列、Genebank收錄號(hào)

表2 三組MII卵母細(xì)胞體外受精后2-細(xì)胞率及囊胚率［n，（%）］

二、各卵母細(xì)胞特異性基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

以5枚MⅡ卵母細(xì)胞為一個(gè)樣本，每實(shí)驗(yàn)組取8個(gè)樣本，對(duì)組間相對(duì)表達(dá)量行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)H1foo亞型H1foo-α在玻璃化冷凍復(fù)蘇組的表達(dá)顯著低于新鮮-復(fù)蘇液處理組及新鮮-對(duì)照組（P＜0.05），而另一亞型H1foo-β及其他四個(gè)卵母細(xì)胞特異性基因Bmp15、Gdf9、Sohlh2和Nobox的mRNA 表達(dá)在組間無(wú)顯著差異。應(yīng)用GraphPad Prism 軟件做圖結(jié)果如下（圖1～5）。

三、H1foo兩個(gè)亞型在新鮮-對(duì)照組和玻璃化冷凍復(fù)蘇組MⅡ卵母細(xì)胞中蛋白表達(dá)的比較

每組以50 枚MⅡ卵母細(xì)胞作為一個(gè)樣本，對(duì)H1foo兩個(gè)亞型進(jìn)行Western blot檢測(cè)，并以β-actin作為內(nèi)參。掃膜后每組均在42kD和37kD處有兩條顯影帶（α、β亞型），其中玻璃化冷凍復(fù)蘇組卵母細(xì)胞的H1foo-α蛋白表達(dá)顯著低于新鮮-對(duì)照組卵母細(xì)胞，而另一亞型H1foo-β在兩組間的表達(dá)則無(wú)顯著差異（圖6）。

圖1 H1foo（卵母細(xì)胞特異性組蛋白）兩亞型mRNA 在新鮮-對(duì)照組、新鮮-復(fù)蘇液處理組、玻璃化冷凍復(fù)蘇組卵母細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 Bmp15（骨形態(tài)發(fā)生蛋白15）mRNA 在新鮮-對(duì)照組、新鮮-復(fù)蘇液處理組、玻璃化冷凍復(fù)蘇組卵母細(xì)胞中的表達(dá)

圖3 Gdf9（生長(zhǎng)分化因子9）mRNA 在新鮮-對(duì)照組、新鮮-復(fù)蘇液處理組、玻璃化冷凍復(fù)蘇組卵母細(xì)胞中的表達(dá)

圖4 Nobox（新生卵巢同源基因）mRNA 在新鮮-對(duì)照組、新鮮-復(fù)蘇液處理組、玻璃化冷凍復(fù)蘇組卵母細(xì)胞中的表達(dá)

圖5 Sohlh2（精卵結(jié)合生成堿性螺旋蛋白2）mRNA在新鮮-對(duì)照組、新鮮-復(fù)蘇液處理組、玻璃化冷凍復(fù)蘇組卵母細(xì)胞中的表達(dá)

圖6 新鮮-對(duì)照組和玻璃化冷凍復(fù)蘇組MⅡ卵母細(xì)胞中H1foo兩亞型蛋白的表達(dá)

討 論

近年來(lái)，人類(lèi)輔助生育技術(shù)在我國(guó)迅速發(fā)展，其中胚胎及卵母細(xì)胞的冷凍保存是該領(lǐng)域的一項(xiàng)重要成就。目前，胚胎冷凍保存的技術(shù)已較為成熟并常規(guī)應(yīng)用于臨床工作，而卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)的成熟與凍卵所獲子代安全性問(wèn)題仍是該領(lǐng)域發(fā)展的重點(diǎn)和難點(diǎn)［7］。卵母細(xì)胞因其體積大、所含水分多、膜滲透性低等特點(diǎn)及冷凍過(guò)程中的冰晶形成，使其凍融復(fù)蘇率較低、復(fù)蘇后體外受精所獲胚胎發(fā)育潛能受到影響［8］。孫貽娟等［9］對(duì)10例患者86枚卵母細(xì)胞凍存后ICSI受精率及獲胚率等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后受精率和卵裂率未顯著下降，但是優(yōu)質(zhì)胚胎比率低，臨床妊娠率也較新鮮卵母細(xì)胞低。Liang等［10］在玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞及早期胚胎甲基化模式改變的研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠卵母細(xì)胞玻璃化冷凍復(fù)蘇后2-細(xì)胞胚胎率（62.28%）及囊胚率（43.68%）較 新 鮮 卵 母 細(xì) 胞 顯 著 下 降（81.47%，61.99%）。因此，找到冷凍技術(shù)對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生影響的具體環(huán)節(jié)和機(jī)制是完善該技術(shù)的重要前提和依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)除新鮮-對(duì)照組及玻璃化冷凍復(fù)蘇組外，加入了單純新鮮-復(fù)蘇液處理組，將玻璃化冷凍技術(shù)分兩個(gè)階段進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇液處理后其卵裂率及囊胚率較新鮮-對(duì)照組未見(jiàn)顯著下降，而玻璃化冷凍復(fù)蘇組卵母細(xì)胞復(fù)蘇后2-細(xì)胞率較新鮮-對(duì)照組及新鮮-復(fù)蘇液處理組顯著下降，囊胚形成率與其他兩組比較則無(wú)顯著差異。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示玻璃化冷凍技術(shù)對(duì)卵母細(xì)胞及其早期胚胎發(fā)育造成不良影響（卵裂率下降），這一影響發(fā)生在投入液氮至復(fù)蘇這一階段，而非由復(fù)蘇液毒性所造成。而卵裂胚向囊胚發(fā)育這一過(guò)程則未因卵母細(xì)胞冷凍而被抑制，考慮原因?yàn)椋盒∈笈咛プ?-細(xì)胞起進(jìn)入中囊胚轉(zhuǎn)化期（MBT），胚胎的發(fā)育由母型基因控制向合子基因控制過(guò)渡［11］，即2-細(xì)胞前胚胎的發(fā)育受卵母細(xì)胞基因調(diào)控，玻璃化冷凍技術(shù)如若對(duì)卵母細(xì)胞基因表達(dá)或發(fā)育潛能產(chǎn)生影響，則這種影響主要發(fā)生在卵母基因控制發(fā)育期間，后期胚胎發(fā)育則主要由合子基因調(diào)控。

卵母細(xì)胞特異性基因是一類(lèi)在卵母細(xì)胞或卵丘細(xì)胞中特異表達(dá)、與卵母細(xì)胞及早期胚胎發(fā)育密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，其功能涉及轉(zhuǎn)錄控制、DNA 空間構(gòu)象、表觀遺傳修飾等，貫穿卵母細(xì)胞從GV 向MII發(fā)育成熟及受精后早期胚胎發(fā)育的全過(guò)程［5］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ）超家族成員骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（Bmp15）和生長(zhǎng)分化因子9（Gdf9）對(duì)早期卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞功能起重要調(diào)控作用，是卵巢內(nèi)重要的旁分泌因子［12］，魏莉娜等［13］對(duì)ICSI助孕者卵丘細(xì)胞內(nèi)Gdf9 及Bmp15mRNA 表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)二者表達(dá)水平與卵母細(xì)胞成熟率、正常受精率、卵裂率均呈顯著正相關(guān)；新生卵巢同源基因（Nobox）及精卵結(jié)合生成堿性螺旋蛋白2（Sohlh2）則通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄影響卵母細(xì)胞質(zhì)量［14，15］。H1foo是哺乳動(dòng)物各期卵母細(xì)胞及早期胚胎中持續(xù)表達(dá)的連接組蛋白，存在α、β兩亞型，在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的完成、受精時(shí)精子染色質(zhì)重構(gòu)、早期胚胎發(fā)育及體細(xì)胞核移植過(guò)程中基因表達(dá)、染色質(zhì)表觀遺傳修飾等方面具有不可替代的作用。目前越來(lái)越多的研究開(kāi)始以H1foo的表達(dá)情況作為衡量卵母細(xì)胞質(zhì)量和早期胚胎發(fā)育潛能的標(biāo)準(zhǔn)之一［16］。本實(shí)驗(yàn)選取上述五個(gè)卵母細(xì)胞特異性發(fā)育相關(guān)基因?qū)θM卵母細(xì)胞進(jìn)行mRNA表達(dá)量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇液處理后及玻璃化冷凍復(fù)蘇后卵母細(xì)胞中Bmp15、Gdf9、Sohlh2、Nobox及H1foo-β亞型的mRNA 表達(dá)水平較新鮮卵母細(xì)胞并無(wú)顯著改變，H1foo-α亞型則在冷凍復(fù)蘇后顯著下降，這一變化在蛋白水平也通過(guò)Western-blot得到了印證。本實(shí)驗(yàn)顯示玻璃化冷凍-復(fù)蘇這一過(guò)程使卵母細(xì)胞內(nèi)H1foo-α的mRNA及蛋白表達(dá)量顯著下降，而H1foo恰是自2-細(xì)胞起逐漸被體細(xì)胞型H1替代［17］，其功能主要在卵母細(xì)胞及2-細(xì)胞前胚胎發(fā)揮。與上一實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合分析可發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞玻璃化冷凍可能通過(guò)降低卵母細(xì)胞特異性組蛋白H1foo-α表達(dá)水平，進(jìn)而影響其在受精至2-細(xì)胞胚胎這一發(fā)育過(guò)程中的作用發(fā)揮，最終使2-細(xì)胞胚胎率下降。

本實(shí)驗(yàn)從基因表達(dá)層面對(duì)玻璃化冷凍技術(shù)安全性進(jìn)行了研究，但其中具體機(jī)制及通路尚需通過(guò)干預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。2012年9月ARSM（美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)）頒布了成熟卵母細(xì)胞冷凍保存指南，摘下了卵母細(xì)胞凍存“試驗(yàn)性技術(shù)”的標(biāo)簽［18］，該技術(shù)成為輔助生殖及女性生育力保存的常規(guī)技術(shù)已指日可待。而玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞、胚胎甚至子代的影響仍需更多基礎(chǔ)研究和機(jī)制探索，以期為該技術(shù)的完善和成熟提供科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)。

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