吳庚香，楊菁，尹太郎，徐望明，李維，余楠，鄒宇潔，張博，王雅琴

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種以內(nèi)分泌紊亂為主，多種代謝異常的異質(zhì)性臨床綜合征，發(fā)病率為4%～8%［1］。該病發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，胰島素抵抗（IR）可能是PCOS發(fā)生發(fā)展的主要因素之一。有研究報(bào)道PCOS婦女發(fā)展為2型糖尿?。?-DM）的危險(xiǎn)性較正常婦女高2～6倍［2］。

熱休克蛋白（HSP）是所有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞在生理、病理及環(huán)境因素（高溫、缺氧或病毒感染、應(yīng)激）下均可產(chǎn)生的一組高度保守的蛋白質(zhì)分子家族，具有多種生物學(xué)功能［3］。PCOS 可能是機(jī)體長(zhǎng)期應(yīng)激的結(jié)果，或是卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞或顆粒細(xì)胞的不正常凋亡所導(dǎo)致［4］，這兩種狀態(tài)都離不開(kāi)HSP的作用。Jansen 等［5］發(fā) 現(xiàn)PCOS 患 者 卵 巢 中 編 碼HSP 的五種基因表達(dá)水平升高，即 HSP40B、HSP70B、HSP70-1A、HSP70-1B 和HSP90-1α，其中HSP70是主要成分。

已有多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)HSP 與2-DM 的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系［6-7］，并認(rèn)為在2-DM 的發(fā)病機(jī)制中氧化應(yīng)激具有主要作用。研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者血清中HSP70濃度較正常對(duì)照組顯著升高［8］。然而在PCOS伴2-DM 中HSP70的表達(dá)情況目前尚未有研究報(bào)道，因此研究PCOS及PCOS伴2-DM 大鼠卵巢中HSP70的表達(dá)情況，可以進(jìn)一步明確HSP70在PCOS及其遠(yuǎn)期并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制中的可能作用機(jī)理。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

21日齡未成年雌性SD 大鼠，購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、PCOS 組和PCOS伴2-DM 模型組，每組各20只，各組大鼠分籠編號(hào)飼養(yǎng)。

二、主要試劑及配制

注射用硫酸普拉睪酮鈉（揚(yáng)州奧賽康藥業(yè)）；鏈脲佐菌素（STZ）（Sigma，美國(guó)）以0.1mmol／L 的檸檬酸鹽緩沖液（pH 4.2）溶解，配制成1% STZ 溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，經(jīng)濾菌器除菌后使用；兔抗鼠HSP70單克隆抗體、SABC-AP 試劑盒（武漢博士德生物），量子點(diǎn)超敏熒光試劑盒-605（QDs-SA）（武漢珈源生物）。

三、研究方法

1.動(dòng)物模型構(gòu)建：大鼠PCOS 及PCOS 伴2-DM動(dòng)物模型構(gòu)建方法參照李維等［9］方法。簡(jiǎn)單介紹如下：所有大鼠均于21日齡斷乳，喂以自制的高脂高糖飼料，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)2d；自23日齡起，PCOS組及PCOS伴2-DM 組大鼠每日18：00～20：00頸部皮下注射硫酸普拉睪酮鈉9mg／100g［相當(dāng)于脫氫表雄酮（DHEA）6mg／100g］，即配制的20mg／ml溶液按0.45ml／100g劑量給藥，連續(xù)注射20d；DHEA 注射完次日20：00起，兩組大鼠均禁食12h，稱量體重，PCOS伴2-DM 組腹腔快速注射1%STZ溶液，按45mg／kg計(jì)算給藥劑量，而PCOS組則腹腔注射0.5 ml檸檬酸鹽緩沖液。正常對(duì)照組大鼠每天皮下注射注射用水0.4ml，連續(xù)注射20d，次日20：00起，大鼠禁食12h，稱量體重，并腹腔注射0.5ml檸檬酸鹽緩沖液。

各組處理完成后所有大鼠恢復(fù)飲食，72h后斷尾采血，并用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，采血及取卵巢組織。卵巢組織用4%多聚甲醛固定。

2.血液激素、胰島素和血糖測(cè)定：取下腔靜脈血液，指標(biāo)主要有E2、睪酮（T）、LH、FSH 以及胰島素（INS），均采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。血糖測(cè)定取尾靜脈血，血糖儀分析隨機(jī)血糖，血糖≥16.7mmol／L者為2-DM 造模成功［10］。

3.量子點(diǎn)熒光標(biāo)記檢測(cè)HSP70的表達(dá)：將卵巢組織切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液中（0.0l M，pH 6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，加2%BSA 37 ℃封閉30min，單克隆兔抗鼠HSP70抗體與Tris緩沖液（TBS）按1∶100的比例加樣后4 ℃孵育過(guò)夜；生物素化的羊抗兔IgG 與TBS 按1∶50 比例加樣，37℃孵育30min后，以TBS-T 洗3次，每次2min，加BSA 在37 ℃封 閉20 min；QDs-SA605 采 用2%BSA 稀釋終濃度20nmol／L滴加覆蓋組織標(biāo)本，37℃孵育1h；TBS-T 洗3次，每次2min。TBS再洗5min，緩沖甘油封片，保存在4 ℃冰箱中待觀察。

4.免疫組化染色：參照免疫組化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。兩種陰性對(duì)照中均采用TBS 代替兔抗鼠HSP70 抗體，其余操作相同。在熒光顯微鏡（OlympusⅨ70，日本）下觀察結(jié)果，采用Biosens Digital Imaging System 系統(tǒng)（V1.6，上海）進(jìn)行圖像灰度值分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，均數(shù)間多重比較采用Fisher LSD 檢 驗(yàn)，多 組 間 比 較 采 用 One-way ANONA；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組卵巢組織學(xué)比較

3組中PCOS組大鼠死亡1只，PCOS伴2-DM組死亡1只以及因血糖不達(dá)標(biāo)3只，剔除出組。組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：PCOS組及PCOS 伴2-DM 組大鼠卵巢表面可見(jiàn)較多囊性擴(kuò)張的卵泡，PCOS 組更為明顯，卵泡內(nèi)未見(jiàn)卵母細(xì)胞和放射冠，顆粒細(xì)胞層變薄至2～3層甚至消失，卵泡膜細(xì)胞增生，較少有黃體形成；正常對(duì)照組卵巢切面可見(jiàn)不同發(fā)育時(shí)期的卵泡及多個(gè)黃體形成，成熟卵泡內(nèi)可見(jiàn)卵母細(xì)胞和放射冠，顆粒細(xì)胞呈多層（圖1）。

二、血液指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組相比，兩模型組血清E2、T 濃度均明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩模型組其血清胰島素（INS）及空腹血糖（FBG）與對(duì)照組相比，均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PCOS伴2-DM 組的血液中INS及FBG 濃度均高于PCOS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

三、免疫組化法觀察大鼠卵巢組織中HSP70的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示：正常組大鼠卵巢組織中有HSP70的表達(dá)，其中顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞中表達(dá)較多，卵泡膜細(xì)胞為弱表達(dá)，且均主要為胞質(zhì)表達(dá)；PCOS組大鼠卵巢中的表達(dá)較正常組明顯增強(qiáng)，表達(dá)部位基本相同；PCOS伴2-DM 大鼠卵巢中為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，且顆粒細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)于卵泡膜細(xì)胞（圖2）。

通過(guò)對(duì)各組灰度值測(cè)量比較可以看出HSP70的表達(dá)強(qiáng)度為正常組＜PCOS組＜PCOS伴2-DM組（表2）。

四、量子點(diǎn)熒光標(biāo)記法觀察大鼠卵巢組織中HSP70的表達(dá)

QDs-SA605標(biāo)記后在藍(lán)光激發(fā)下陽(yáng)性位點(diǎn)為橘紅色熒光，組織為黃綠色背景熒光。在各組大鼠卵巢組織中均可見(jiàn)紅色熒光，即HSP70表達(dá)，顆粒細(xì)胞中熒光強(qiáng)度高于卵泡膜細(xì)胞，表達(dá)趨勢(shì)為正常組＜PCOS組＜PCOS伴2-DM 組，與免疫組化結(jié)果一致（圖3）。

圖1 各組大鼠卵巢HE染色（×400）

表1 各組大鼠血液測(cè)定指標(biāo)的比較（±s）

表1 各組大鼠血液測(cè)定指標(biāo)的比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，＊P＜0.05；與PCOS組相比，※P＜0.05

組 別 例數(shù) E2（pmol／L）T（nmol／L）LH（U／L）FSH（U／L）INS（mU／L）FBG（mmol／L）PCOS組 19 85.14±7.19＊ 1.59±0.27＊ 4.40±0.94 4.20±0.91＊ 5.19±0.96＊ 11.81±2.60＊PCOS伴2-DM 組 16 87.35±7.19＊ 1.51±0.20＊ 4.39±1.12＊ 3.66±0.79 6.14±1.45＊※ 17.32±2.35＊※對(duì)照組 20 54.20±8.81 0.82±0.17 3.81±0.72 3.61±0.86 3.07±0.68 3.66±0.57

圖2 免疫組化檢測(cè)各組大鼠卵巢中HSP70的表達(dá)

表2 各組大鼠卵巢組織HSP70表達(dá)值比較（±s）

表2 各組大鼠卵巢組織HSP70表達(dá)值比較（±s）

注：與正常對(duì)照組相比，＊P＜0.05；與PCOS組相比，※P＜0.05

組 別表達(dá)值PCOS組 100.43±8.23＊PCOS伴2-DM 組 110.87±18.18＊※正常組87.35±7.64

圖3 量子點(diǎn)熒光標(biāo)記檢測(cè)各組大鼠卵巢中HSP70的表達(dá)（×400）

討 論

本文采用李維等［9］的方法，通過(guò)硫酸普拉睪酮鈉聯(lián)合高脂高糖飼料＋低劑量STZ誘導(dǎo)SD 幼年雌性大鼠的PCOS伴2-DM 的動(dòng)物模型，結(jié)果顯示硫酸普拉睪酮鈉誘導(dǎo)SD 幼年雌性大鼠PCOS 動(dòng)物模型卵巢病理改變及內(nèi)分泌改變與PCOS患者相似，卵巢呈多囊樣改變，并且存在著明顯的高胰島素血癥。硫酸普拉睪酮鈉聯(lián)合低劑量STZ誘導(dǎo)的PCOS伴2-DM 動(dòng)物模型表現(xiàn)出與PCOS伴2-DM 患者相似的內(nèi)分泌特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，再次證實(shí)這種造模方法模型的穩(wěn)定性。

大量的研究表明，胰島素抵抗與PCOS之間存在著密切的關(guān)系，胰島素抵抗可能是PCOS發(fā)生發(fā)展的主要因素之一。據(jù)報(bào)道肥胖型PCOS患者高胰島素血癥發(fā)生率高達(dá)75%［11］，而在普通人群中胰島素抵抗的發(fā)生率僅為10%～25%。生育期PCOS婦女伴2-DM 的發(fā)病率為7.2%，28～30 歲PCOS婦女中2-DM 的發(fā)病率為4%～10%，PCOS的婦女發(fā)展為2-DM 的危險(xiǎn)性較正常婦女高2～6 倍［2］。但是目前關(guān)于PCOS的病因和其具體的發(fā)病機(jī)制以及PCOS如何發(fā)展為2-DM 仍然不清楚。

HSP70是HSP 家族中最保守、含量最豐富的一類(lèi)HSP，它廣泛分布于線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞外，與多種細(xì)胞功能有關(guān)［12］。正常情況下，HSP70呈持續(xù)性低水平表達(dá)，應(yīng)激刺激下表達(dá)量升高。研究發(fā)現(xiàn)HSP70可通過(guò)多種機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡［13］。Jansen等［5］對(duì)PCOS患者卵巢中異常基因的表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)編碼HSP 的五種基因表達(dá)水平升高，即HSP40B、HSP70B、HSP70-1A、HSP70-1B和HSP90-1α，其中HSP70 為主要成份。Salvetti等［14］對(duì)大鼠PCOS的研究發(fā)現(xiàn)HSP70在卵巢內(nèi)所有細(xì)胞中表達(dá)，胞核、胞質(zhì)均表達(dá)，且在囊狀卵泡中的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中表達(dá)最多。本研究通過(guò)量子點(diǎn)熒光標(biāo)記及免疫組化法再次證實(shí)HSP70在大鼠卵巢組織中有表達(dá)，在PCOS及PCOS伴2-DM大鼠卵巢中均發(fā)現(xiàn)囊狀卵泡的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中HSP70表達(dá)最高，且高于對(duì)照組，與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果一致。我們認(rèn)為HSP70表達(dá)增加可以抑制囊狀卵泡凋亡，使囊狀卵泡持續(xù)存在，進(jìn)而形成卵巢的多囊樣改變，同時(shí)HSP70在PCOS組卵泡膜中表達(dá)水平較高，提示HSP70可抑制卵泡膜細(xì)胞凋亡，形成PCOS的高雄激素血癥。

越來(lái)越多的研究表明HSP與2-DM 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2-DM 患者血清HSP70的水平明顯高于正常對(duì)照組［6］，糖尿病的病程越長(zhǎng)，其血清HSP70的水平越高。在病程大于5年的患者中血清HSP70水平與空腹血糖水平負(fù)相關(guān)，與年齡正相關(guān)［7］。因此，HSP在防止胰島素抵抗的產(chǎn)生及2-DM 的發(fā)展中具有潛在的作用。本研究結(jié)果顯示HSP70在PCOS伴2-DM 中表達(dá)最強(qiáng)。PCOS婦女通常伴隨有胰島素抵抗、氧化應(yīng)激和輕度慢性炎癥，2-DM 的發(fā)病機(jī)制為胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞功能受損，氧化應(yīng)激在2-DM的發(fā)病機(jī)制中起主要作用。STZ對(duì)動(dòng)物的胰島β細(xì)胞具有高度選擇性破壞作用，小劑量STZ誘導(dǎo)大鼠胰腺β細(xì)胞株INS-1凋亡，大劑量則導(dǎo)致壞死。本研究采用的是高脂高糖飲食及DHEA 誘導(dǎo)胰島素抵抗后予以小劑量STZ的方法建立PCOS伴2-DM 模型，因此在注射STZ后，大鼠體內(nèi)產(chǎn)生了氧化應(yīng)激和急性炎癥，STZ誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡，而HSP70具有抗凋亡作用，故在PCOS伴2-DM 大鼠中HSP70水平明顯高于正常對(duì)照組和PCOS組。但對(duì)人類(lèi)來(lái)說(shuō)，PCOS伴2-DM 是一個(gè)緩慢的進(jìn)展過(guò)程，與我們實(shí)驗(yàn)中注射STZ短時(shí)間造成的糖尿病模型可能存在一定的差異，故尚需進(jìn)一步探索更符合人類(lèi)生理病理變化的PCOS伴2-DM 動(dòng)物模型，以更準(zhǔn)確地研究PCOS進(jìn)展為2-DM的機(jī)制，進(jìn)而采取相應(yīng)的措施預(yù)防和治療PCOS伴2-DM。

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