崔穎++王秀娟++高山++王國澤

摘要：實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累來實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的轉(zhuǎn)變。介紹了實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的原理、分類及優(yōu)缺點(diǎn)，綜述了近年來實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在植物中的應(yīng)用概況及其研究進(jìn)展，旨在為該技術(shù)的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

關(guān)鍵詞：實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)；原理；內(nèi)參基因；植物抗逆性；轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品

中圖分類號：Q503；Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）13-3073-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.001

The Application of Real-time Fluorescent Quantitative PCR in Plant

CUI Ying，WANG Xiu-juan，GAO Shan，WANG Guo-ze

（School of Mathematical Physics and Biology Engineering， Inner Mongolia University of Science and Technology，

Baotou 014010， Inner Mongolia， China）

Abstract： Real-time fluorescent quantitative PCR （RQ-PCR） is a detection method by adding fluorescent dyes or fluorescent probe into the PCR reaction system，using fluorescent signal accumulation to monitor amplification reactions of PCR reaction process，and finally the unknown template can be quantitative through the standard curve.So the detection level of PCR has improved from the qualitative to the quantitative.In order to provide theoretical reference for further application，the principle， classification，advantages and disadvantages of RQ-PCR were introduced，and its application and progress in plants in recent years were reviewed.

Key words：real-time fluorescent quantitative PCR（RQ-PCR）；principle；reference gene；stress resistance of plant；transgenic products

20世紀(jì)80年代凱利·穆利斯（Kary Mullis）發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction， PCR）[1]。該技術(shù)是體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列最常用的方法。但其定量方法只能通過凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物來進(jìn)行分析，由于平臺效應(yīng)的存在，定量的準(zhǔn)確性受到影響，且操作過程中易污染而使得假陽性率高。準(zhǔn)確地說常規(guī)PCR是一種定性的技術(shù)。直到1996年Applied Biosystems公司推出實(shí)時熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，RQ-PCR）技術(shù)，它不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，RQ-PCR具有簡便易行、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而且也有效解決了常規(guī)PCR假陽性率高等缺點(diǎn)[2]。

1 RQ-PCR技術(shù)的概述

RQ-PCR技術(shù)是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它將核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時檢測等技術(shù)融合在一起。RQ-PCR反應(yīng)即是在常規(guī)PCR反應(yīng)中加入熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR的不斷進(jìn)行，PCR產(chǎn)物在逐步積累，熒光信號也相應(yīng)地發(fā)生有規(guī)律的變化。每經(jīng)過一次循環(huán)就可以收集一個熒光信號。這樣就可以繪出一條熒光擴(kuò)增曲線圖（圖1）。通常，該圖呈“S”型，分為3個時期：熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)期和平臺期[3]。

在熒光背景信號階段，由于擴(kuò)增的熒光信號會被PCR儀系統(tǒng)內(nèi)部存在的固有熒光信號所遮蓋，因此無法進(jìn)行定量；在平臺期，PCR的終產(chǎn)物量與起始拷貝數(shù)之間無相應(yīng)的線性關(guān)系。只有在指數(shù)期，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量存在線性關(guān)系，可以由此階段進(jìn)行定量分析[4]。簡而言之，所謂RQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

2 RQ-PCR的分類

RQ-PCR的類型分為探針式和非探針式。其中非探針式又成為染料法，是利用染料或特殊設(shè)計的引物來指示擴(kuò)增的增加。其優(yōu)點(diǎn)是簡便易行，缺點(diǎn)是無特異性。而探針式則是利用與靶序列特異性雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。其優(yōu)點(diǎn)是特異性高，缺點(diǎn)是探針設(shè)計難度大，成本高。

2.1 探針式熒光檢測技術(shù)

探針式熒光檢測技術(shù)就是利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理來設(shè)計探針[5]，在探針5′端標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)（Reporter，R），3′端標(biāo)記一個淬滅基團(tuán)（Quencher，Q），二者可以構(gòu)成能量傳遞。當(dāng)R基團(tuán)與Q基團(tuán)距離較近時，Q基團(tuán)可以吸收或抑制R基團(tuán)發(fā)出的熒光；當(dāng)R基團(tuán)和Q基團(tuán)相距較遠(yuǎn)時，Q基團(tuán)則不能再吸收或抑制R基團(tuán)所發(fā)出的熒光，這時R基團(tuán)的熒光釋放出來，熒光信號增強(qiáng)。常用的有TaqMan探針、分子信標(biāo)等。endprint

2.2 非探針式熒光檢測技術(shù)（染料法）

該方法是利用染料無法與單鏈DNA結(jié)合而可以與雙鏈DNA結(jié)合并在結(jié)合時發(fā)出熒光信號，而在游離狀態(tài)下則不發(fā)出熒光信號[6]的原理得以實(shí)現(xiàn)的。因此可以用熒光信號強(qiáng)度來代表雙鏈DNA的數(shù)量，進(jìn)而來計算PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物量。目前主要使用的是SYBR Green I。

3 不同熒光探針及SYBR Green I熒光染料的優(yōu)缺點(diǎn)

不同熒光探針及SYBR Green I熒光染料的分類情況、優(yōu)缺點(diǎn)對比及在實(shí)踐中的應(yīng)用概況如表1所示。

4 RQ-PCR的優(yōu)缺點(diǎn)

RQ-PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)下加入熒光染料或熒光探針，這樣PCR的每次循環(huán)都會檢測到熒光信號的變化。在進(jìn)行RQ-PCR時，我們只需在加樣時打開一次PCR反應(yīng)管，之后所有的檢測和定量都是在電腦分析軟件下進(jìn)行的。所以RQ-PCR與常規(guī)PCR相比存在許多優(yōu)點(diǎn)，但也有自身的不足。其優(yōu)點(diǎn)在于特異性好、準(zhǔn)確性和自動化程度高且節(jié)約時間，缺點(diǎn)是所需熱循環(huán)儀和試劑相對普通PCR昂貴[14，15]。

5 RQ-PCR技術(shù)在植物中的應(yīng)用

RQ-PCR技術(shù)是一種很好的檢測基因表達(dá)的方法，通過RQ-PCR可以分析植物在不同處理?xiàng)l件下基因樣本的表達(dá)差異，也可以分析植物在不同生長發(fā)育時期基因表達(dá)的差異。

5.1 植物中內(nèi)參基因的篩選

RQ-PCR是檢測低豐度mRNA的敏感方法，通過比較不同樣本的RNA產(chǎn)量、質(zhì)量及逆轉(zhuǎn)錄上可能存在的差別，獲得目的基因特異性表達(dá)的真正差異。但是在應(yīng)用RQ-PCR檢測目的基因表達(dá)量時，必須選擇合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[16]。內(nèi)參基因是指其表達(dá)水平不受研究條件的影響且可以在多種樣本間恒定表達(dá)的已知參照基因[17]。因此，內(nèi)參基因在進(jìn)行擴(kuò)增中的變化可以反映出RNA數(shù)量、質(zhì)量和cDNA合成效率的變化。

在植物學(xué)研究中，常用的穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因有甘油醛-3-磷酸-脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因[18]、肌動蛋白基因（actin）[19]、微管蛋白基因（tubulin）[20]和18s RNA[21]等。然而，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)一種內(nèi)參基因可適用于所有植物樣本進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。因此，在進(jìn)行RQ-PCR分析中，必須根據(jù)樣品的不同來選擇一種或一種以上的內(nèi)參基因進(jìn)行校正，以盡量去除試驗(yàn)中的不穩(wěn)定因素[22]。geNorm軟件是一種內(nèi)參基因選擇的良好工具，該軟件首先將某一內(nèi)參基因與其他內(nèi)參基因表達(dá)水平進(jìn)行兩兩比較和對數(shù)轉(zhuǎn)換，獲得平均標(biāo)準(zhǔn)差后并將該平均標(biāo)準(zhǔn)差作為基因表達(dá)穩(wěn)定度的平均值M，然后將所有候選內(nèi)參基因的M值進(jìn)行排序，M值越小，基因表達(dá)穩(wěn)定度越高，同時判定樣本所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目[23]。

Kong等[24]用RQ-PCR檢測了甜瓜在生物脅迫、非生物脅迫及植物生長調(diào)節(jié)劑處理的根和葉中以及果實(shí)不同發(fā)育階段下14種常用內(nèi)參基因的表達(dá)量，并確定了相應(yīng)的最適內(nèi)參基因。Borowski等[25]利用RQ-PCR分析了傳統(tǒng)的14種內(nèi)參基因和新的3種MIR169，MIR170/171，MIR172基因，發(fā)現(xiàn)生菜受到鹽脅迫時傳統(tǒng)的14種內(nèi)參基因最為合適；而在重金屬脅迫、干旱脅迫等非生物脅迫下，3種新的基因更適合做內(nèi)參基因。Chan等[26]對采用RQ-PCR技術(shù)對油棕的內(nèi)參基因進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)pOP-EA01332，PD00380和PD00569的穩(wěn)定性高于其傳統(tǒng)的管家基因。

5.2 RQ-PCR技術(shù)對植物中抗性基因的表達(dá)分析

近年來對植物抗性基因的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)和焦點(diǎn)問題，傳統(tǒng)的Northern blot和常規(guī)PCR方法很難準(zhǔn)確和快速分析出該基因的表達(dá)量差異，而RQ-PCR技術(shù)具有快速和準(zhǔn)確分析出植物在不同處理?xiàng)l件下該基因表達(dá)量差異的特點(diǎn)。

選取適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因，并設(shè)計出疑似抗性基因和已選取的內(nèi)參基因引物，在對植物進(jìn)行了不同處理后通過RQ-PCR技術(shù)檢測疑似抗性基因和內(nèi)參基因的表達(dá)量。其表達(dá)量的確定是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的線性計算出來的，就是將樣品的Ct值代入公式，得到其相對濃度。同一個模板中的疑似抗性基因和內(nèi)參基因的相對濃度的比值即可作為疑似抗性基因相對表達(dá)水平，從而來幫助確定抗性基因[27]。

徐德昌等[28]利用RQ-PCR技術(shù)檢測了甜菜在低溫脅迫下相關(guān)基因miRNA中表達(dá)的變化量，證明miRNA156、157、167、319、396是甜菜中響應(yīng)低溫信號的調(diào)控分子。馮靜弦等[29]利用RQ-PCR技術(shù)檢測擬南芥在熱脅迫下的miRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)mi414，415837-5p，f10546-akr這3種相關(guān)基因在表達(dá)量上發(fā)生了變化。揚(yáng)帆等[30]和Srivastava等[31]采用RQ-PCR技術(shù)分別分析了鹽脅迫下構(gòu)樹DREB轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量的變化及不同程度的鹽脅迫下芥菜種子應(yīng)答的全部基因組，并以此來鑒定抗逆性的信號傳遞。Song等[32]用cDNA-AFLP技術(shù)分析了河北楊在干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)，并利用RQ-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)了不同失水量下的24個轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)模式。Dung等[33]通過RQ-PCR技術(shù)評測了大豆組織在各種非生物脅迫下的內(nèi)參基因。

5.3 RQ-PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的應(yīng)用

植株在轉(zhuǎn)化過程中外源基因DNA片段是隨機(jī)插入植物基因組內(nèi)的，插入的拷貝數(shù)一般是不固定的。因此，轉(zhuǎn)基因植物中外源基因拷貝數(shù)常影響目的基因的表達(dá)水平和遺傳穩(wěn)定性。由此可見，轉(zhuǎn)基因研究中關(guān)鍵的一步就是檢測外源基因的拷貝數(shù)，以篩選出拷貝數(shù)少或是單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株供給進(jìn)一步的研究和育種[34]。

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)檢測主要是Southern blot，但該方法工作量大，需要的DNA材料較多，費(fèi)時費(fèi)力，并且經(jīng)常需要用到放射性同位素等具有潛在危險的藥品，而RQ-PCR具有高通量、快速、靈敏、安全等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測中[35]。endprint

5.3.1 用來確定是否為轉(zhuǎn)基因食品 利用RQ-PCR技術(shù)，采用相對定量法，根據(jù)Ct值與起始模板數(shù)的對數(shù)值呈反比線性關(guān)系的原理制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得Ct值與起始模板數(shù)的相對線性方程，將樣品的Ct值代入該方程就可獲得目的基因的起始模板數(shù)，通過與內(nèi)參基因的比較就可以知道基因組中該外源基因拷貝數(shù)，由此則可以判斷出該食品是否為轉(zhuǎn)基因食品[36]。

目前已經(jīng)用于對轉(zhuǎn)基因的大豆、玉米、小麥、油菜等作物的檢測[37]。Hernandez等[38]利用RQ-PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因玉米MON810中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了檢測。Taverniers等[39]利用RQ-PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因油菜子中的Barnase基因進(jìn)行了檢測。Mieog等[40]用RQ-PCR技術(shù)快速分析轉(zhuǎn)基因谷物中的純合體。Mohamed等[41]用RQ-PCR檢測了轉(zhuǎn)基因杏中的嵌合體并有效地監(jiān)控其分離。Madhugiri等[42]利用RQ-PCR的靈敏性來檢測木瓜種子轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的混合體。

5.3.2 用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品含量的檢測 利用RQ-PCR技術(shù)分別對轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品進(jìn)行擴(kuò)增，記錄下其各自內(nèi)參基因和目的基因的Ct值，計算出標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)參基因和目的基因的Ct值之差，即△Ct，然后以標(biāo)準(zhǔn)品的轉(zhuǎn)基因百分含量與△Ct作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算待測樣品中的轉(zhuǎn)基因百分含量[43]。

目前TaqMan探針已經(jīng)被用在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的定量檢測上，靈敏度達(dá)到0.1%[43]。Hird等[44]利用RQ-PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因大豆、玉米進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，大豆與標(biāo)準(zhǔn)含量的誤差僅為0.1%，在3種不同玉米品種的誤差僅為2.0%、10.0%和7.0%。陳穎等[45，46]利用RQ-PCR技術(shù)對大豆和玉米的內(nèi)源基因和外源基因進(jìn)行了檢測并建立了商業(yè)化轉(zhuǎn)基因大豆以及轉(zhuǎn)基因玉米的定量方法。

5.4 RQ-PCR技術(shù)對植物同源基因的分析

利用RQ-PCR技術(shù)對植物同源基因進(jìn)行檢測，可以幫助理解用來編碼蛋白質(zhì)基因的功能[47]。Shimada等[48]利用RQ-PCR技術(shù)檢測了擬南芥中油菜素甾醇的生物合成、分解和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，為油菜素甾醇的代謝提供了一個更完整的途徑。Anterola等[49]利用RQ-PCR證實(shí)了松樹中有7個至關(guān)重要的基因?qū)δ举|(zhì)素前體物質(zhì)的新陳代謝起到調(diào)節(jié)作用。

6 應(yīng)用前景

因?yàn)镽Q-PCR具有特異性好，精確性高，可以定量檢測，并且誤差小以及操作簡便，自動化程度高，擴(kuò)增和檢測一步完成等優(yōu)點(diǎn)，所以目前已廣泛用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域，如mRNA表達(dá)和研究、SNP、人類和動物疾病的快速檢測等方面[50]。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，再結(jié)合其他技術(shù)，RQ-PCR技術(shù)將會在許多領(lǐng)域有所發(fā)展，尤其是在植物育種、植物病理檢疫等方面有望發(fā)揮更大的作用[51]。

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收稿日期：2014-11-15

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260406）；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012MS0502）

作者簡介：崔 穎（1989-），女，內(nèi)蒙古包頭人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)楣卟珊笊锛夹g(shù)，（電話）15949482207（電子信箱）

cuiying_1989@126.com；通信作者，王國澤（1975-），女，內(nèi)蒙古赤峰人，教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏方向的研究，

（電子信箱）lycwgz@126.com。endprint