左雪枝

摘要：以蛹蟲草（Cordycps militaris）子實(shí)體為母本，采用組織分離法和子囊單孢子配對(duì)法制備子代母種，以母種菌絲形態(tài)、平板培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)速度、見光培養(yǎng)菌絲轉(zhuǎn)色性能、實(shí)際栽培出草結(jié)果等為菌種性能主要考察指標(biāo)，探索優(yōu)質(zhì)菌種提純復(fù)壯規(guī)律及方法。結(jié)果表明，菌種菌絲濃密、健壯、匍匐狀，生長(zhǎng)快、轉(zhuǎn)色好，則出草形態(tài)好、產(chǎn)量高；組織分離法制備母種試管斜面菌絲形態(tài)優(yōu)良率、平板生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)色優(yōu)良率、栽培出草優(yōu)良率可達(dá)約95%、90%和85%，分別比子囊單孢子配對(duì)法高約10%、25%和40%，后者可產(chǎn)生約20%的更優(yōu)菌株。說(shuō)明組織分離法更適合遺傳和保持母本性狀，子囊單孢子配對(duì)法更適合篩選更優(yōu)菌株，兩種方法均可作為蛹蟲草優(yōu)良菌株提純復(fù)壯的方法。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草（Cordycps militaris）；組織分離法；單孢子配對(duì)培養(yǎng)法；產(chǎn)量

中圖分類號(hào)：S567.3+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）13-3177-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.028

Purification-Rejuvenation and Its Law of Cordyceps militaris

ZUO Xue-zhi

（College of Bioengineering， Jingchu University of Technology， Jingmen 448000， Hubei， China）

Abstract：The mother plate culture mycelial morphology， mycelial growth rate， light color， the actual performance of mycelia grown grass results of strain performance of Cordyceps militaris were investigated by the quality of C. militaris as female parent， tissue isolation method and spore culture method paired preparation of sub mother. And the relevant quality spawn rejuvenation rules and method were explored. Results showed that the percentages of fine colonies in tube culture，plate culture， and the percentage of good growth， of spawn prepared by tissue isolation could attain 95%，90%，and 85% respectively， which were separately 10%，25% and 40% higher than those spawn prepared by monospore pairing cultivation， although the latter could produce 20% even better colonies. It was suggested that tissue isolation method was more suitable for the conservation of genetic and maternal character， while spore culture method was a more appropriate choice for screening better strains，although both methods could be used for the rejuvenation of the fine strain of C. militaris.

Key words： Cordyceps militaris； tissue isoloation； spore cultivation； yield

蛹蟲草（Cordycps militaris）又名北冬蟲夏草、北蟲草，為蟲草菌科（Cordycipitaceae）蟲草屬（Cordyceps Link）模式種[1]，20世紀(jì)末中國(guó)在世界上率先實(shí)現(xiàn)其人工栽培，目前規(guī)?；斯ぴ耘嗉捌渖罴庸ぎa(chǎn)業(yè)已初步形成[2，3]。然而，由于蛹蟲草菌種極容易退化，已成為其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的主要瓶頸[3，4]。如何選育和延續(xù)優(yōu)良菌種性能，確立優(yōu)良母種制備及提純復(fù)壯方法，對(duì)普及和發(fā)展蛹蟲草人工栽培具有重要意義。菌種選育實(shí)踐證明，從具有優(yōu)良性狀的真菌子實(shí)體中，以組織分離法及經(jīng)減數(shù)分裂所形成的單孢子配對(duì)是選育優(yōu)良菌種的基本和有效的方法。為此，從一般蛹蟲草種植者急需對(duì)優(yōu)良子實(shí)體進(jìn)行良種選育及保持母本優(yōu)良性狀的實(shí)際出發(fā)，比較和探討了子實(shí)體組織分離法和子囊單孢子配對(duì)法在蛹蟲草良種選育及菌株復(fù)壯過程中的規(guī)律、特點(diǎn)及相關(guān)技術(shù)參數(shù)，以供相關(guān)人員借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌種

優(yōu)質(zhì)蛹蟲草原始母種D1由荊楚理工學(xué)院食用菌實(shí)驗(yàn)室分離、保藏和提供，供試子實(shí)體為該母種瓶栽后代。

1.2 培養(yǎng)基

母種分離培養(yǎng)基（改良PDA培養(yǎng)基）：200 g馬鈴薯（去皮），20 g葡萄糖，5 g蛋白胨，1 g磷酸二氫鉀，0.8 g硫酸鎂，15 g瓊脂，去離子水定容至1 000 mL，pH自然（實(shí)測(cè)值約6.5）；

栽培岀草培養(yǎng)基：30 g大米，45 mL營(yíng)養(yǎng)液。其中營(yíng)養(yǎng)液配方：30 g蠶蛹粉，1 g磷酸二氫鉀，0.8 g硫酸鎂，10 mg 維生素B1，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.5；

液體菌種培養(yǎng)基：30 g可溶性淀粉，10 g葡萄糖，10 g蛋白胨，2 g磷酸二氫鉀，2 g硫酸鎂，10 mg 維生素B1，去離子水定容至1 000 mL，pH 6.5；

菌絲生長(zhǎng)及性能檢測(cè)培養(yǎng)基（平板培養(yǎng)基）：200 g馬鈴薯（去皮），20 g葡萄糖，10 g蛋白胨，15 g瓊脂，1 g磷酸二氫鉀，0.8 g硫酸鎂，10 mg 維生素B1，去離子水定容至1 000 mL，pH自然；

1.3 方法

1.3.1 子代母種的制備 選取子實(shí)體數(shù)目較多、普遍粗且長(zhǎng)、顏色典型、生長(zhǎng)健壯的蛹蟲草數(shù)瓶，從中選擇較優(yōu)子實(shí)體作為組織分離及子囊單孢子分離材料。組織分離法：以無(wú)菌去離子水清洗子實(shí)體3～4次，無(wú)菌條件下切取中上部2～3 cm小段，刮去橘紅色外皮，切成1～2 mm小塊，接入改良PDA試管斜面，適宜溫度避光培養(yǎng)[5]（Y1）。單子囊孢子配對(duì)法：選取約七分熟子座，無(wú)菌去離子水沖洗，無(wú)菌濾紙吸干后懸掛于改良PDA錐形瓶平板上部，20 ℃恒溫避光培養(yǎng)；當(dāng)子囊單孢子彈射并在培養(yǎng)基平面形成數(shù)個(gè)早期小單孢菌落時(shí)[6]，隨機(jī)選取2個(gè)單孢菌落轉(zhuǎn)移至新的試管斜面并相互靠近，20 ℃避光培養(yǎng)（Y2）。各試管菌絲長(zhǎng)滿斜面即為子代母種。觀察各組母種及各菌株菌絲色澤、形態(tài)、生長(zhǎng)趨勢(shì)等情況，與優(yōu)質(zhì)母種相比較，初步判斷母種性能及差異。

1.3.2 母種轉(zhuǎn)接至平板培養(yǎng)基 將制備的各子代母種取1 mm大小菌塊，分別接種至菌絲生長(zhǎng)及性能檢測(cè)培養(yǎng)基，先避光培養(yǎng)5 d后再光照培養(yǎng)5 d，觀察各組及各菌株菌絲形態(tài)、生長(zhǎng)速度、轉(zhuǎn)色程度等情況[7]；

1.3.3 母種轉(zhuǎn)擴(kuò)為液體菌種 另取制備的各子代母種5 mm大小菌塊，接入150 mL液體培養(yǎng)基中，搖床150 r/min培養(yǎng)5～7 d至液體菌種成熟，比較觀察各組及各菌株菌絲球大小、濃密、菌液狀況[8]；

1.3.4 栽培出草及菌種性能分析 將成熟后的液體菌種，按培養(yǎng)基體積的約10%接種量接入栽培出草培養(yǎng)基（本試驗(yàn)接入量均為6 mL），置于人工氣候箱中適宜條件下培養(yǎng)[9]，比較觀察各組及各菌株在菌絲萌發(fā)、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)色、出草、子實(shí)體形態(tài)、產(chǎn)量等方面表現(xiàn)出的菌種性能及規(guī)律。以出草產(chǎn)量及質(zhì)量為主要指標(biāo)，分析探究不同提純復(fù)壯方法對(duì)菌種性能的影響、趨勢(shì)及規(guī)律。試驗(yàn)以優(yōu)質(zhì)原始蛹蟲草母種為對(duì)照（Y0），5個(gè)重復(fù)（編號(hào)1～5）；各試驗(yàn)組制備復(fù)壯菌種20個(gè)菌株（編號(hào)1～20）；各菌株栽培出草10瓶重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始母種培養(yǎng)性能及栽培出草

原始母種平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)及栽培出草結(jié)果見表1。從表1可以看出，Y0組各菌株于試管斜面避光培養(yǎng)階段均表現(xiàn)為潔白、濃密、健壯，緊貼斜面匍匐狀生長(zhǎng)，氣生菌絲少，形態(tài)基本一致。

2.2 組織分離法復(fù)壯菌種性能及栽培出草

Y1組各菌株平板及液體培養(yǎng)特征、栽培出草情況見表2。從表2可以看出，各菌株于試管斜面均表現(xiàn)為潔白、匍匐狀，僅20號(hào)菌株長(zhǎng)勢(shì)較差，菌絲較瘦弱、稀少，其余各菌株與優(yōu)良親本母種形態(tài)較為一致。

從表2可以看出，Y1組各菌株平板避光及見光培養(yǎng)表現(xiàn)出一定性狀差異。其中1～18號(hào)原潔白、健壯、濃密、匍匐狀菌株，平板培養(yǎng)菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、轉(zhuǎn)色程度等與Y0組基本一致，出草結(jié)果亦與Y0組較為接近；僅19及20號(hào)菌株轉(zhuǎn)為淡黃色，前者出草能力顯著低下、后者不能出草。結(jié)合表1，顯然與其轉(zhuǎn)色性能較差有關(guān)。14號(hào)菌株生長(zhǎng)速度較快，出草量亦較高。從各菌種菌株液體培養(yǎng)情況來(lái)看，1～18號(hào)菌株菌液細(xì)密黏稠，與其菌絲生長(zhǎng)較快性能相一致，說(shuō)明其液體培養(yǎng)生物量較高，因而出草形態(tài)較好、產(chǎn)量亦較高。從該組各菌株整體情況看，試管及平板避光培養(yǎng)，菌絲潔白、健壯、濃密、匍匐狀，則生長(zhǎng)速度較快，見光培養(yǎng)轉(zhuǎn)色性能較好，液體培養(yǎng)菌絲球細(xì)密、菌液黏稠，出草性能較好；尤其轉(zhuǎn)色性能與出草結(jié)果有較大的一致性，說(shuō)明菌絲潔白、健壯、濃密、匍匐狀，液體培養(yǎng)菌絲細(xì)密黏稠，尤其轉(zhuǎn)色性能良好，是優(yōu)良菌種的重要表現(xiàn)。試驗(yàn)中也觀察到，瘦弱、絨毛狀菌株生長(zhǎng)較慢，轉(zhuǎn)色性能較差，生物量顯著低于其他菌株，栽培出草過程菌絲吃料緩慢、不出草。

2.3 單子囊孢子配對(duì)復(fù)壯菌種性能及栽培出草

單子囊孢子配對(duì)復(fù)壯菌種各菌株平板、液體培養(yǎng)及栽培出草情況見表3。從表3可以看出，Y2組各菌株于母種斜面階段即較Y1組菌株性狀分化明顯。其中，1～17號(hào)菌株菌絲潔白、健壯、濃密、匍匐狀，18、19號(hào)菌株氣生菌絲較明顯、瘦弱，長(zhǎng)勢(shì)較差；20號(hào)菌株氣生菌絲明顯，呈絨毛狀且色較暗。

從表3可以看出，1～16號(hào)菌株平板培養(yǎng)仍保持母種匍匐、濃密狀性狀，生長(zhǎng)較快，絕大部分菌株轉(zhuǎn)色性能較好，液體培養(yǎng)菌液細(xì)密黏稠，出草量亦較高。進(jìn)一步說(shuō)明菌絲潔白、健壯、濃密、匍匐狀生長(zhǎng)較快、可良好轉(zhuǎn)色及菌液黏稠細(xì)密，是菌種優(yōu)良性狀表現(xiàn)。其中，7、8、11及6號(hào)菌株生長(zhǎng)較迅速、轉(zhuǎn)色明顯較快、較深，菌液亦較黏稠細(xì)密，出草量亦明顯超過對(duì)照組，可達(dá)19～21 g/瓶的較高水平；而9、4號(hào)菌株盡管菌絲生長(zhǎng)速度高于7、8和11號(hào)菌株，但由于不轉(zhuǎn)色或轉(zhuǎn)色淡，不出草。16～20號(hào)菌株母種斜面或平板培養(yǎng)即已表現(xiàn)出稀疏、瘦弱、氣生菌絲較多、絨毛狀、色暗或生長(zhǎng)較緩慢等不良性狀，光照培養(yǎng)轉(zhuǎn)色淡或不轉(zhuǎn)色，液體培養(yǎng)大都菌絲球粗大、菌液較清澈，栽培不出草。顯然較Y1具有更強(qiáng)的變異性及兩極分化趨勢(shì)，其中部分菌株更優(yōu)，有利于復(fù)壯和選育更優(yōu)菌株。

2.4 復(fù)壯菌種性能與出草結(jié)果分析

出草產(chǎn)量及子實(shí)體形態(tài)是菌種性能的根本體現(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，Y1及Y2組各菌株出草產(chǎn)量及子實(shí)體形態(tài)表現(xiàn)有明顯差異，產(chǎn)量較高者，草體形態(tài)典型；產(chǎn)量較低者，草體矮小、分叉、叢枝等畸形；以形態(tài)及產(chǎn)量與對(duì)照組相當(dāng)或較接近為優(yōu)良（大于15 g/瓶），草體明顯畸形且產(chǎn)量明顯較低為劣質(zhì)（低于5 g/瓶），則Y1和Y2組出草結(jié)果差別明顯。Y1組出草率高達(dá)95%，且優(yōu)質(zhì)草率達(dá)85%，劣質(zhì)及不出草率10%；而Y2組出草率僅達(dá)約60%，但草體大多形態(tài)典型、產(chǎn)量較高。進(jìn)一步跟蹤各組各菌株試管斜面、平板及轉(zhuǎn)色培養(yǎng)、實(shí)際栽培出草等菌種性能，可以看出，盡管Y1及Y2復(fù)壯方式不同，其試管斜面培養(yǎng)、平板生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)色、液體培養(yǎng)、栽培出草特征及其優(yōu)良率均呈一定下降趨勢(shì)，其中良好轉(zhuǎn)色一般可獲得較好出草結(jié)果。分析其原因，菌種菌株避光培養(yǎng)菌絲潔白、濃密、健壯，緊貼培養(yǎng)基表面匍匐生長(zhǎng)，氣生菌絲少，生長(zhǎng)迅速，則有利于菌絲體從培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)部吸收充足營(yíng)養(yǎng)；液體培養(yǎng)菌絲球細(xì)密、菌液黏稠，則菌絲細(xì)胞較多、代謝旺盛而易于積累相關(guān)物質(zhì)，為見光轉(zhuǎn)色、出草等生殖生長(zhǎng)奠定了良好的基礎(chǔ)。良好轉(zhuǎn)色是生殖生長(zhǎng)的重要標(biāo)志，是出草等生殖生長(zhǎng)過程的重要環(huán)節(jié)和基礎(chǔ)[9，10]。菌絲潔白、濃密、健壯、匍匐狀生長(zhǎng)快、見光轉(zhuǎn)色好、轉(zhuǎn)色快、轉(zhuǎn)色深，則菌種萌發(fā)快、滿瓶時(shí)間短、出草形態(tài)好、產(chǎn)量高；相反菌絲瘦弱、灰暗、氣生菌絲多、轉(zhuǎn)色淺則不出草或?yàn)榱淤|(zhì)草，尤其不轉(zhuǎn)色則不出草，與菌種培養(yǎng)性能基本相吻合。說(shuō)明菌種固體及液體培養(yǎng)特征是菌種性能的基本體現(xiàn)，其中良好轉(zhuǎn)色是栽培出草的重要基礎(chǔ)。其中，Y2組中4株菌株其菌種性能及產(chǎn)量明顯高于對(duì)照組，可用于選育、提純及復(fù)壯更優(yōu)菌株。

3 小結(jié)與討論

組織分離法及孢子配對(duì)法是絲狀真菌菌種分離及良種選育的主要方法。鎖現(xiàn)民等[5]、楊玉紅等[6]研究結(jié)果表明，以蛹蟲草子實(shí)體中上部及尖端組織作分離材料，菌種性能較佳，本試驗(yàn)鑒于蛹蟲草菌絲性能易于退化，以菌絲組織形成較晚的子實(shí)體中上部為分離材料，證實(shí)以其提純及復(fù)壯菌種，出草優(yōu)良率可達(dá)85%，說(shuō)明組織分離法可較好地保持和遺傳母本優(yōu)良性狀，且操作較為簡(jiǎn)便，可作為一般蛹蟲草種植戶及優(yōu)質(zhì)蛹蟲草菌種分離、篩選及提純復(fù)壯的方法。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果還表明，以單子囊孢子配對(duì)方式制備及復(fù)壯菌種，盡管不出草比例可高達(dá)約40%，但出草菌株大多形態(tài)典型、產(chǎn)量較高，更優(yōu)菌株比例可達(dá)約20%，與潘葳[10]、高新華等[11]的研究結(jié)果基本一致。梁宗琦[12]、高新華[13]研究證實(shí)，蛹蟲草為二極性異宗配合，潘葳[10]、高新華等[11]、梁月等[14]進(jìn)一步證實(shí)少數(shù)單子囊孢子在適宜條件下仍可正常出草、存在“假同宗配合”等現(xiàn)象，說(shuō)明盡管蛹蟲草有性生殖過程復(fù)雜，但仍應(yīng)以單子囊孢子配對(duì)作為篩選、復(fù)壯和選育更優(yōu)菌株的主要方法。試驗(yàn)還進(jìn)一步表明，在菌種分離、復(fù)壯及良種選育過程中，可選取菌絲濃密、健壯、匍匐狀，氣生菌絲少，生長(zhǎng)迅速，轉(zhuǎn)色快且深，作為優(yōu)良菌種初步篩選的主要指標(biāo)，但仍應(yīng)以栽培出草試驗(yàn)作為菌種性能鑒定的根本依據(jù)。

致謝：本文在荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院方華舟老師指導(dǎo)下完成，孫露露、談晶等同學(xué)亦做了大量的試驗(yàn)工作，在此一并表示感謝！

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