周 悅，吳亞輝，盧俊求，蔣 艷，王曉麗

（廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005）

隨著生物醫(yī)學的發(fā)展，人們逐漸意識到建立卵母細胞保存庫的重要性。玻璃化冷凍是一種簡便快速的冷凍方法，成為低溫生物學領域的研究熱點之一。冷凍解凍后卵母細胞的發(fā)育潛力明顯受損，這與冷凍過程造成卵母細胞損傷密切相關。豬卵母細胞含有大量的脂滴，對低溫的耐受性差，這給豬卵母細胞的冷凍造成了很大的困難[1-5]。關于豬卵母細胞冷凍保存研究尚處于探索階段，特別是玻璃化冷凍對豬卵母細胞的超微結構的影響等方面的研究，目前國內報道較少，本研究利用透射電鏡技術對玻璃化冷凍前后的GV期和MII期豬卵母細胞超微結構變化進行了研究，旨在為研究豬卵母細胞的玻璃化冷凍機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 卵母細胞的收集和體外成熟培養(yǎng) 豬卵巢由廣西大學豬場獲得。卵巢取出后迅速放入35℃～37℃的0.9%NaCl溶液（添加75 mg/L青霉素和50 mg/L鏈霉素）中，1 h內送到實驗室。用18號針頭的10 mL注射器選取直徑3～8 mm的卵泡抽取卵丘卵母細胞復合體（COCs），放入10 mL離心管置于39℃恒溫槽中靜置沉淀，待15 min后，棄去上清液，用TCM-199液稀釋沉淀，倒置顯微鏡下?lián)斐霭|均勻，有多層卵丘細胞包裹的卵丘卵母細胞復合體。成熟液洗3次后的COCs放入39℃，5%CO2和100%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)44 h獲得成熟卵母細胞。

1.2 方法

1.2.1 冷凍液與解凍液的配置 基礎液（HM）：TCM199+20%FCS（胎牛血清）；冷凍平衡液：HM+7.5%（DMSO+EG）；冷凍液：HM+17%（DMSO+EG）+0.4M Su；HM+15%（DMSO+EG）+0.5 mol/L Su；解凍液I：HM+0.5 mol/L Su；解凍液II：HM+0.25 mol/L Su；解凍液Ⅲ：HM。

1.2.2 卵母細胞的冷凍與解凍 卵母細胞經(jīng)7.5%μg/mL的CB液孵育15 min后，移入平衡液預處理3～5min，形態(tài)恢復正常后，放入冷凍液處理30 s內裝入半麥管，直接投入液氮中保存。解凍時，取出半麥管，快速將含卵母細胞端浸入已平衡好的解凍液I中5 min，移入解凍液II，解凍液III中分別5 min，洗滌數(shù)次，放入培養(yǎng)箱中恢復培養(yǎng)待用。

1.2.3 透射電鏡樣品制備 卵母細胞經(jīng)PBS清洗數(shù)次，2.5%戊二醛4℃條件下固定2 h后，PBS洗滌3次。用2%瓊脂聚集卵母細胞，鋨酸固定2 h，PBS洗滌3次。梯度乙醇脫水，環(huán)氧丙烷置換，純Epon 812中包埋。顯微鏡下修塊，半薄切片，進行定位，超薄切片，200目銅網(wǎng)撈片，干燥，醋酸雙氧鈾-檸檬醋酸雙重染色，透射電鏡下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 每組試驗重復5次，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件統(tǒng)計分析，進行X2顯著性檢驗。

2 結果及分析

2.1 GV期卵母細胞超微結構觀察 GV期卵母細胞與透明帶連接緊密，微絨毛（Mv）呈細長狀伸入透明帶（ZP）中，長短不一，皮質區(qū)分布大量的線粒體（Mi）（圖1a）。質膜下極少見皮質顆粒，皮質區(qū)還可見大量成簇的長管狀結構（圖1b）。皮質區(qū)散在高爾基體（Ga）及囊泡樣結構（圖1c）。線粒體一般呈圓形，橢圓形，少數(shù)呈不規(guī)則形，大小不規(guī)律，線粒體清晰的雙層膜結構，電子密度較高。細胞質內可見許多脂滴（LD），可分為兩種，一種為灰色脂滴（GLD），一種為深色脂滴（DLD），且脂肪滴的周圍由內質網(wǎng)不連續(xù)包裹著，線粒體與脂滴相伴出現(xiàn)（圖1d）。

2.2 MII期卵母細胞超微結構觀察 MII期卵母細胞達到成熟的第一特點排出第一極體，極體的細胞核包圍大量的粗面內質網(wǎng)使其呈現(xiàn)指紋狀，極體位于透明帶及卵母細胞之間，與卵母細胞緊密相連（圖1e）。MII期卵母細胞達到成熟的第二特點為排列在質膜下的大量的皮質顆粒（CG），皮質顆粒為黑色圓形顆粒（圖1e）。皮質區(qū)微絨毛（Mv）縮短成矮柱狀，線粒體（Mi）散在分布且貼近細胞膜，呈現(xiàn)向細胞內逐漸增多的趨勢（圖1f）。透明帶與細胞間形成較大的卵周隙（PVS）（圖1g）。線粒體呈圓形，內膜形成的嵴清晰可見，細胞內部線粒體聚集存在。深色脂滴和灰色脂滴由內質網(wǎng)形成邊界，可觀察到線粒體及內質網(wǎng)伴隨脂滴分布，皮質區(qū)主要分布深色脂滴，且比灰色脂滴體積要大（圖1h）。

2.3 玻璃化冷凍后GV期卵母細胞超微結構的變化 玻璃化冷凍后GV期卵母細胞透明帶、細胞膜損傷，微絨毛（Mv）消失（圖1i），皮質區(qū)有成簇的線粒體（Mi）群，線粒體腫脹，基質不均、嵴不明顯（圖1j），脂滴（LD）主要為深色脂滴，包圍脂滴的內質網(wǎng)（ER）不完整、電子密度較高（圖1k），伴隨脂滴有腫脹的線粒體分布。胞質內溶解為絮狀，有大量空泡，未見高爾基體（Ga）（圖1l）。

2.4 玻璃化冷凍后MII期卵母細胞超微結構的變化 玻璃化冷凍后MII期卵母細胞透明帶（ZP）損傷，邊緣不平整，微絨毛、細胞膜損傷甚至消失（圖1m）。皮質顆粒排列在質膜下，但數(shù)量減少（圖1n）。皮質區(qū)以深色脂滴為主，脂滴外圍包裹的內質網(wǎng)破損或消失（圖1o）。細胞內部以灰色脂滴為主，但脂滴部分溶解，相互連接（圖1p），脂滴周圍伴隨大量腫脹呈圓形的線粒體，大小不一，線粒體嵴不明顯，有的線粒體電子密度增大（圖1p）。

3 討論

合理選擇冷凍保護劑，運用適當?shù)睦鋬龇椒梢杂行岣呃鋬霰Ｗo作用，減少冷凍損傷。細胞松弛素B（CB）[6]是一種細胞骨架穩(wěn)定劑，可以通過調節(jié)細胞骨架柔韌性達到降低卵母細胞低溫敏感的效果。目前CB已經(jīng)成功應用于牛[7]、豬[8]、山羊[9]等多種動物的卵母細胞冷凍保護中并起到了積極的保護作用。對于豬卵母細胞的冷凍前處理還有離心去脂，化學去脂等，但尚未得到一致有效結果。因此為獲得良好的冷凍效果，本研究采用了CB冷凍前預處理卵母細胞。

卵母細胞中線粒體分布廣泛，容易受到發(fā)育環(huán)境的影響。老年小鼠的MII期卵母細胞線粒體的異常定位率顯著高于青年小鼠[10]，說明卵母細胞的后續(xù)發(fā)育能力受線粒體的正確空間定位的支配。戴建軍[11]用羅丹明123對豬卵母細胞冷凍后的線粒體進行觀察，發(fā)現(xiàn)線粒體變得模糊粗糙，線粒體嵴減少或者消失，凍融后線粒體的正常率只有50%左右，說明線粒體的損傷是造成卵母細胞解凍后發(fā)育能力減弱的因素之一。朱淑文等[12]采用平皿-玻璃化冷凍豬卵母細胞，結果發(fā)現(xiàn)，豬卵母細胞經(jīng)冷凍后對線粒體的損傷并不嚴重，只有少部分線粒體電子致密度下降、體積膨大和嵴消失，顯示平皿-玻璃化冷凍豬卵母細胞對線粒體損傷較輕。本研究發(fā)現(xiàn)，半麥管法玻璃化冷凍對成熟前后的卵母細胞的線粒體都有嚴重損傷，說明不同的冷凍方法和不同的冷凍載體對線粒體冷凍損傷程度不同。

圖1 玻璃化冷凍對豬卵母細胞超微結構的影響

透明帶由少數(shù)幾種糖蛋白組成，是包裹在哺乳動物卵母細胞外側，負責調控和調節(jié)受精的各個步驟。因為精子要先結合到透明帶上，引發(fā)頂體反應從而穿透透明帶，才可以與卵質膜的特異受體相融合，進而正常受精，當精質膜與卵質膜融合后才會釋放皮質顆粒[13]。有研究表明，玻璃化冷凍會造成透明帶硬化，影響卵母細胞受精作用[14-15]。張德福[16]用0.5%鏈酶蛋白酶處理胚胎后，發(fā)現(xiàn)透明帶消化雖然沒有提高存活率，但顯著提高了囊胚率。說明凍融后透明帶結構的改變制約了胚胎的發(fā)育能力。凍融后卵母細胞微絨毛減少，消失可能會減弱卵母細胞的發(fā)育能力[17]。而武彩紅[18]的研究卻發(fā)現(xiàn)，用鏈酶蛋白酶消化透明帶的時間顯著低于新鮮卵母細胞，并提出冷凍未造成透明帶硬化。但該研究僅對消化時間進行統(tǒng)計，并未進行發(fā)育能力的研究。

豬的卵母細胞的特點是含有大量的脂滴，脂滴分為深色脂滴和褐色脂滴兩種，通常脂滴周圍由內質網(wǎng)包裹。不同動物所含脂滴含量有所區(qū)別，豬和狗卵母細胞內所含脂滴較多，鼠類卵母細胞所含脂滴較少[19]。近年來的研究，也圍繞如何克服脂滴的低溫敏感性而大量展開。陸文昊[20]采用化學去脂法和離心法處理MII期卵母細胞發(fā)現(xiàn)，化學去脂后的卵母細胞進行玻璃化冷凍可以獲得較高的卵裂率和囊胚率，化學去脂對提高MII期卵母細胞的玻璃化冷凍效果是有效的。說明脂滴的冷凍損傷是導致卵母細胞玻璃化冷凍后發(fā)育能力減弱的因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)凍融后的卵母細胞脂滴形態(tài)破壞，形成空泡化，內質網(wǎng)與脂滴的聯(lián)系損壞，與上述研究結果相一致。

卵母細胞還具有一個特殊的細胞器是皮質顆粒，當卵母細胞未成熟時，皮質顆粒分泌較少且散在分布于細胞質中，當卵母細胞逐漸成熟皮質顆粒開始向質膜遷移，卵母細胞達到成熟后，皮質顆粒在質膜下呈單層連續(xù)排列。皮質顆粒在皮質下的單層排列也是卵母細胞達到成熟的一大標志[13-14]，說明本研究所觀察的MII期卵母細胞已達成熟。本研究發(fā)現(xiàn)在冷凍解凍后的卵母細胞中很少見到皮質顆粒，可能是冷凍劑的處理和低溫造成皮質顆粒提前釋放，這與Myers等[19]報道的由于冷凍保護劑中滲透壓的作用導致皮質顆粒發(fā)生胞吐作用及質膜的破損基本一致，也與朱淑文等[12]采用平皿-玻璃化冷凍豬卵母細胞對皮質顆粒影響一致。

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