李智萌　張彥飛　蔡廣知等

[摘要] 目的 改進(jìn)中藥茺蔚子的炮制工藝，考察影響中藥茺蔚子的炮制因素。 方法 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，考查中藥茺蔚子的酒炒工藝，并對(duì)其進(jìn)行多因素分析?？疾鞓?biāo)準(zhǔn)以茺蔚子中鹽酸水蘇堿為指標(biāo)，采用高效液相色譜結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）對(duì)其進(jìn)行含量測定，采用方差分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析數(shù)據(jù)，找出最佳的優(yōu)化方案。 結(jié)果 水煎煮提取的最佳工藝為A1B3C3，即加水煎煮3次，第1次加8倍量水，浸泡1 h，煎煮1.5 h；第2次加6倍量水，煎煮1.5 h，第3次加6倍量水，煎煮1.5 h，濾過，合并濾液。炮制最佳工藝為A3B2C1D3，即使用25%加酒量浸潤茺蔚子藥材10 min后，將其在150℃下炒制5 min后即得。 結(jié)論 炮制的方法直接影響中藥茺蔚子中鹽酸水蘇堿的含量，本研究為改進(jìn)中藥茺蔚子的最佳炮制工藝提供了參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 茺蔚子；炮制工藝優(yōu)化；鹽酸水蘇堿；高效液相色譜結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測器

[中圖分類號(hào)] R283 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2015）05（c）-0016-04

[Abstract] Objective To improve the processing technology of the Chinese traditional medicine Motherwort fruit，and investigate the factors influencing for the processing of Chinese traditional medicine Motherwort fruit. Methods The orthogonal experiment was designed to investigate the fried wine processing of Chinese traditional medicine Motherwort fruit，and the multiple-factor analysis was given.Standard for Motherwort fruit was used Hydrochloric acid stachydrine as the index，which was used HPLC-ELSD to determine the content and the data were analyzed statistically by analysis of variance to find out the optimal scheme. Results Optimum water decoction was extracted for A1B3C3，was decocted three times，the first with 8 times amount of water，soaked for 1 h，boiled for 1.5 h；second times with 6 times amount of water，boiled for 1.5 h，third times with 6 times amount of water，decocted for 1.5 h，and then filtered and merged filtrate.The best processing technology for A3B2C1D3 was infiltrated 25% for liquor 10 min and under 150℃ fried for 5 min to obtain. Conclusion The processing methods is a direct impact on the content of stachydrine hydrochloride in Motherwort fruit，this study provides reference for optimizing the best processing method of Motherwort fruit.

[Key words] Motherwort fruit；Optimal processing method；Hydrochloric acid Stachydrine；HPLC-ELSD

中藥茺蔚子又名益母草子，為唇形科植物益母草（Leonurus japonicus Houtt.）的干燥成熟果實(shí)[1]。藥材多秋季果實(shí)成熟時(shí)采割地上部分，曬干，打下果實(shí)，除去雜質(zhì)。該中藥首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味辛、苦，性微寒。歸心包、肝經(jīng)，具有活血調(diào)經(jīng)、清肝明目的功能，用于目赤腫痛或目生翳膜，酒炒品治療頭目之疾最佳[2-4]?！俺粗啤焙汀皟糁啤眱煞N炮制方法是目前中藥茺蔚子的主要炮制方法。為傳承其炮制理論和優(yōu)化其炮制方法，進(jìn)一步使中藥茺蔚子更好地發(fā)揮功效，本研究以酒炒法為主要方法，考察影響酒炒工藝的因素和水平，采用正交試驗(yàn)的方法進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)炮制工藝方法，對(duì)不同炮制方法制得的炮制樣品進(jìn)行試驗(yàn)比較。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（LC-10ATvP型，日本島津公司），蒸發(fā)光散射檢測器（上海分析儀器有限公司），空氣壓縮泵（天津市分析儀器廠），超聲波提取器（上海分析儀器有限公司），85-2A數(shù)顯測速恒溫磁力攪拌器（金壇市榮華儀器制造有限公司），80-2型電動(dòng)離心機(jī)（江蘇金壇市金國勝實(shí)驗(yàn)儀器公司），百萬分之一電子天平，十萬分之一電子天平；水為超純水，磷酸、乙腈為色譜純；鹽酸水蘇堿對(duì)照品（批號(hào)：110710-201310，規(guī)格為20 mg，中國藥品生物制品鑒定所）。

茺蔚子藥材[5]，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取鹽酸水蘇堿對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加70%乙醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取研磨后的茺蔚子粉末過四號(hào)篩，取過篩后的藥材粉末約0.25 g，精密稱定后記錄其準(zhǔn)確重量，轉(zhuǎn)入完全干燥的50 ml具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 ml，加塞，精密稱定重量，記錄，置入超聲提取器中（頻率40 kHz，功率250 W）處理30 min，待完全放冷后，再精密稱定其重量，使用70%乙醇補(bǔ)足與第1次稱量相比減少的重量，充分搖勻，置入漏斗中濾過，棄除濾液，精密取一定量續(xù)濾液，70%乙醇定容后即為供試品溶液[6-8]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察

取鹽酸水蘇堿對(duì)照品，精密稱4.87 mg，完全轉(zhuǎn)入10 ml棕色容量瓶中，先加一定量70%乙醇溶解，待溶解完全后，繼續(xù)加乙醇定容至刻度，充分搖勻，即得（每1毫升含鹽酸水蘇堿對(duì)照品0.487mg）。分別精密吸取上述鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液1、3、5、7、9 μl，注入液相色譜儀，分別記錄相應(yīng)的峰面積值，其中，橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量（μg）取對(duì)數(shù)后的值（X），縱坐標(biāo)為峰面積積分取對(duì)數(shù)后的值（Y），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（圖1）。結(jié)果回歸方程為Y=1.5503X+2.1495，r=0.9999，提示，鹽酸水蘇堿線性范圍為0.487～4.383 μg時(shí)，進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值與峰面積積分的對(duì)數(shù)值之間有良好的線性關(guān)系[9-11]。

2.4 茺蔚子提取方法的考察

遵循中藥湯劑的煎煮方法，確定水作為提取溶劑，提取方法選擇熱法提取，即煎煮法，且固液分離時(shí)應(yīng)注意趁熱濾過，使藥效物質(zhì)較少損失，以保證較高的提取率及臨床療效[12-13]。根據(jù)上述原則，對(duì)水煎煮提取工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)研究。試驗(yàn)考察了3個(gè)因素包括藥材的加水量、煎煮時(shí)間及煎煮次數(shù)，其中每個(gè)因素考察了3個(gè)水平，根據(jù)因素和水平設(shè)計(jì)L9（34）的正交試驗(yàn)（表1），考慮到試驗(yàn)中可能存在誤差的影響，每次試驗(yàn)平行3次。其中藥材的浸泡時(shí)間采用單因素實(shí)驗(yàn)法，以直觀考察進(jìn)行評(píng)價(jià)；其他因素采取L9（34）正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)法，以茺蔚子中有效成分鹽酸水蘇堿的含量為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝參數(shù)。由方差分析表可知各因素影響的重要性順序?yàn)锽>C>A，提示對(duì)試驗(yàn)有顯著性影響的主要因素為煎煮次數(shù)和煎煮時(shí)間，即主要影響因素是煎煮次數(shù)B和煎煮時(shí)間C，加水量A對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際情況及實(shí)驗(yàn)操作，選擇A1。綜合分析結(jié)果，確定最佳提取工藝條件為A1B3C3，即加水煎煮3次，第1次加水8倍量，浸泡1 h，煎煮1.5 h，趁熱濾過；第2次加水6倍量，煎煮1.5 h，趁熱濾過；第3次加水6倍量，煎煮1.5 h，趁熱濾過，合并濾液，即為供試品溶液（表2、表3）。

2.5 茺蔚子酒炒工藝的考察

茺蔚子酒炒工藝設(shè)計(jì)考察了酒炒溫度、酒炒時(shí)間、浸潤時(shí)間和加酒量4個(gè)因素，每個(gè)因素分別設(shè)了3個(gè)水平，根據(jù)因素和水平設(shè)計(jì)了L9（34）正交試驗(yàn)表（表4）?？紤]到試驗(yàn)中可能存在誤差的影響，每次試驗(yàn)平行3次[14-16]。使用最佳提取方法對(duì)炮制后茺蔚子進(jìn)行提取，根據(jù)炮制后鹽酸水蘇堿含量優(yōu)選炮制方法。正交試驗(yàn)的直觀分析見表5，結(jié)果顯示，炮制因素的主次為D>A>C >B，根據(jù)試驗(yàn)實(shí)際操作需求確定最佳組合為A3B1C1D3。由方差分析結(jié)果（表6）可知各因素影響試驗(yàn)結(jié)果的重要顯著因素為A和D，由于B對(duì)試驗(yàn)影響不顯著，故將其列入誤差項(xiàng)處理。根據(jù)最終測得鹽酸水蘇堿含量和飲片外形特征為主要參考指標(biāo)，A3B2C1D3為最終選擇的最佳炮制工藝，即使用25%加酒量浸潤茺蔚子藥材10 min后，將其在150℃下炒制5 min后即得。

2.6 茺蔚子不同炮制品總浸膏量、鹽酸水蘇堿含量測定

取不同炮制品200 g，加水煎煮3次，第1次加8倍量水（其中2倍量是藥材的吸水量），浸泡1 h，煎煮1.5 h；第2次加6倍量水，煎煮1.5 h；第3次加6倍量水，煎煮1.5 h，濾過合并濾液，比較不同炮制方法的浸膏量和鹽酸水蘇堿的含量。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與生品比較，酒炒品總浸膏量、鹽酸水蘇堿含量差異顯著（P<0.01）（表7），可見酒炒品在鹽酸水蘇堿含量上較高，說明優(yōu)化后的酒炒工藝確實(shí)提高了炮制飲片的質(zhì)量。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取已處理的供試品溶液及鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液各5 ml注入液相色譜儀，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，按照上述色譜條件進(jìn)行測定其峰面積，計(jì)算其相應(yīng)的峰面積積分值可知，對(duì)照品溶液和供試品溶液峰面積的RSD值分別為1.59%、2.99%，表明該試驗(yàn)的儀器、方法的精密度良好[17]。

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取已過篩的茺蔚子藥材粉末，按照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備的方法進(jìn)行處理，平行制備6份，依次獨(dú)立測定，按上述色譜條件測定峰面積，計(jì)算茺蔚子藥材中鹽酸水蘇堿的含量，考察試驗(yàn)方法的重復(fù)性，測定其鹽酸水蘇堿含量，結(jié)果平均含量為34.33 mg/g，RSD為1.67%，表明該試驗(yàn)方法具備良好的重復(fù)性。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 每隔一定時(shí)間，分別精密吸取茺蔚子藥材供試品溶液和對(duì)照品溶液各5 μl注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測定其峰面積，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在24 h內(nèi)，測定對(duì)照品溶液和供試品溶液峰面積的RSD分別為1.84%、2.26%，表明鹽酸水蘇堿具備良好的穩(wěn)定性，保證了其在24 h內(nèi)測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠[18]。

2.7.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取茺蔚子藥材樣品，按照供試品制備項(xiàng)下方法處理，平行制備6份，且已測定其鹽酸水蘇堿的含量，向6份供試品中分別適量精密加入對(duì)照品，按照上述色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算茺蔚子藥材中的鹽酸水蘇堿加樣回收率，經(jīng)測定，其鹽酸水蘇堿平均加樣回收率為97.96%，RSD值為0.92%，提示試驗(yàn)方法具備良好的準(zhǔn)確度（表8）。

3 討論

由于茺蔚子具有活血調(diào)經(jīng)、清肝明目的作用，故本實(shí)驗(yàn)以茺蔚子中鹽酸水蘇堿作為主要指標(biāo)對(duì)其炮制方法進(jìn)行考察。優(yōu)化后的酒炒法下鹽酸水蘇堿含量明顯比生品高，可能與茺蔚子經(jīng)酒制后增加了與酒相關(guān)的成分有關(guān)，炒制品的水溶性成分含量和鹽酸水蘇堿含量均高于生品，與中藥傳統(tǒng)炮制理論中“逢子必炒”的理論是相符合的[19-20]。此外，本試驗(yàn)確定茺蔚子的最佳酒炒工藝為使用25%加酒量浸潤茺蔚子藥材10 min后，將其在150℃下炒制5 min后即得，茺蔚子的最佳酒炒工藝為茺蔚子其他炮制工藝提供了參考依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：225.

[2] 陳發(fā)奎.常用中草藥有效成分含量測定[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997.

[3] 王寶琴.中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1994.

[4] 吳壽金，趙泰，秦永祺.現(xiàn)代中草藥成分化學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2001.

[5] 熊佐章.HPLC法測定復(fù)方鹽酸水蘇堿片的含量[J].基層中藥雜志，2002，16（2）：11-13.

[6] 林文群，陳宏靖，陳忠.茺蔚子化學(xué)成分的研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，17（2）：84-87.

[7] 姜舜堯.益母草藥材中水蘇堿成分的高效液相色譜法分析[J].藥物分析雜志，2001，21（4）：243-247.

[8] 劉雅茜，王夢(mèng)月，史海明，等.高效液相色譜法測定甘草及其炮制品中5種活性成分的含量[J].中國藥學(xué)雜志，2008，43（16）：1268-1271.

[9] 孫淑琴，魏廣武.不同炮制方法對(duì)薏苡仁煎液的影響[J].中國中藥雜志，2000，25（11）：60.

[10] 楊能英，夏新華.HPLC測定小兒止咳顆粒中鹽酸水蘇堿的含量[J].中成藥，2003，25（7）：591-592.

[11] 楊懷鏡，姚宏春，張全望.HPLC法測定鹽酸水蘇堿和復(fù)方鹽酸水蘇堿片的含量[J].中國藥事，2003，17（3）：171-172.

[12] 高建，夏泉，黃趙剛，等.HPLC-ELSD同時(shí)測定當(dāng)歸補(bǔ)血總苷中黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ[J].中成藥，2012，34（2）：268-272.

[13] 盧鳳來，蔣海英，陳月圓，等.HPLC-ELSD法測定山銀花中綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙[J].中成藥，2013，35（8）：1821-1823.

[14] 蔣小華，賓祝芳，謝運(yùn)昌，等.HPLC-ELSD法同時(shí)測定紅絲線中的豆甾醇和β-谷甾醇[J].中成藥，2013，35（8）：1711-1713.

[15] 李紅燕，張蕊，馮曉川.HPLC-ELSD法測定復(fù)方枇杷止咳顆粒中桔梗皂苷D、熊果酸、齊墩果酸和貝母素甲[J].中成藥，2013，35（7）：1479-1484.

[16] 陳俊，黃玉鳳，王彬.HPLC-ELSD在中藥分析及指紋圖譜中的應(yīng)用[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2009，27（4）：251-253.

[17] 張蓮珠，王會(huì)弟.茺蔚子研究進(jìn)展[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，10（28）：920-921.

[18] 閆文靜，仲彥穎，汪豪.HPLC-ELSD法測定川牛膝中兩種三萜皂苷的含量[J].藥學(xué)與臨床研究，2014，22（4）：336-338.

[19] 黃勇紅，黃艷萍.飛揚(yáng)草藥材HPLC指紋圖譜研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（16）：72-74.

[20] 王克英，郭思妤，祝晶，等.黔產(chǎn)鉤藤HPLC指紋圖譜的研究[J].中國中藥指南，2012，10（35）：69-70.

（收稿日期：2015-01-29 本文編輯：衛(wèi) 軻）