王雁秋黃 平鄧 旻

絞股藍(lán)總皂苷對糖尿病腎病大鼠nephrin、VEGF表達(dá)及腎功能的影響

王雁秋1黃 平2鄧 旻1

目的觀察絞股藍(lán)總皂苷對糖尿病腎?。―N）大鼠nephrin、VEGF表達(dá)的影響，探討其降低尿蛋白、保護(hù)腎臟的作用機(jī)制。方法采用單側(cè)腎切除加鏈脲佐菌素注射法改良復(fù)制大鼠DN模型，實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、絞股藍(lán)總皂苷高、中、低劑量組和纈沙坦組，每組8只。藥物干預(yù)4周后測定24h尿蛋白、內(nèi)生肌酐清除率、足細(xì)胞相關(guān)分子nephrin及足細(xì)胞分泌的VEGF蛋白在腎臟組織的表達(dá)。結(jié)果絞股藍(lán)總皂苷高劑量組24h尿蛋白明顯低于模型組［（77.04±16.63）mg比（110.56±46.88）mg，P＜0.05］，內(nèi)生肌酐清除率高于模型組［（1.47±0.24）mL·min-1比（1.25±0.23）mL·min-1，P＜0.05］。高劑量組 nephrin 蛋白表達(dá)水平較模型組明顯上調(diào)（0.4250±0.02 比 0.3388±0.02，P＜0.01），VEGF 表達(dá)明顯抑制（0.2588±0.03 比 0.3521±0.01，P＜0.01），且效果類似纈沙坦組。結(jié)論絞股藍(lán)總皂苷能降低DN大鼠尿蛋白，改善腎功能和足細(xì)胞相關(guān)蛋白的異常表達(dá)。

大鼠；糖尿病腎??；足細(xì)胞；絞股藍(lán)總皂苷；nephrin；VEGF

糖尿病腎病（DN）是終末期腎衰竭的常見原因，目前確切的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。足細(xì)胞是維持腎小球?yàn)V過膜最后屏障與結(jié)構(gòu)的主要細(xì)胞。足細(xì)胞損傷在DN進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上通過檢測實(shí)驗(yàn)大鼠腎功能、24h尿蛋白及足細(xì)胞nephrin、VEGF蛋白的表達(dá)，觀察絞股藍(lán)總皂苷對早期糖尿病腎病的影響，進(jìn)一步探討相關(guān)作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 健康SPF級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量200～240g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng),動(dòng)物合格證號：SYXK（浙）2008-0115。

1.2 試 劑 絞股藍(lán)總苷片（安康正大制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z10970130）；纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20040217）；鏈脲佐菌素STZ（美國Sigma公司）；即用型鼠SP檢測試劑盒（SP-9002）、即用型兔 SP檢測試劑盒（SP-9001）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DN模型制作及分組 模型復(fù)制參照楊俊偉等[1]單側(cè)腎切除加STZ注射法。成模標(biāo)準(zhǔn)[2]為血糖＞16.7mmol/L，尿量＞對照組的50%，24h尿蛋白＞對照組的50%。隨機(jī)將成模大鼠分為5組，每組8只：即絞股藍(lán)總皂苷高劑量組（1g/kg）、絞股藍(lán)總皂苷中劑量組（0.5g/kg）、絞股藍(lán)總皂苷低劑量組（0.25g/kg）、纈沙坦（8mg/kg）、模型組（予等體積生理鹽水灌胃）。正常對照組為8只正常大鼠（予等體積生理鹽水灌胃）。大鼠血糖升高1周后（第8天）開始固定時(shí)間空腹灌胃給藥，1天1次，干預(yù)時(shí)間持續(xù)4周。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水和攝食。

2.2 大鼠血、尿檢測 各組大鼠均于治療前及治療28天后提前一天以代謝籠留取24h尿液標(biāo)本測定24h尿蛋白、尿肌酐；治療28天后腹腔麻醉，空腹取靜脈血測定血肌酐、尿素氮。

2.3 免疫組化測定nephrin、VEGF表達(dá)及半定量分析 nephrin采用即用型兔檢測試劑盒（SP-9001），VEGF采用鼠SP檢測試劑盒（SP-9002）：腎組織經(jīng)脫蠟水化，PBS沖洗后浸入枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，按照說明書要求滴加一抗原，次日PBS沖洗后DAB顯色，蘇木素核復(fù)染，中性樹膠封片。以腎小球內(nèi)棕黃色顆粒且染色強(qiáng)度高于背景者為陽性表達(dá)，陰性不顯色。每例標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)不重疊腎小球視野（×400），分別檢測腎小球內(nèi)陽性表達(dá)信號的平均光密度和面積，用Image-pro-plus6.0軟件進(jìn)行半定量分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 24h尿蛋白比較 藥物干預(yù)4周后，絞股藍(lán)總皂苷中、高劑量組，纈沙坦組大鼠24h尿蛋白較治療前下降（P＜0.05），且均低于模型組（P＜0.05）。絞股藍(lán)總皂苷低劑量組大鼠尿蛋白較前增多，與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠24h尿蛋白比較（mg，±s）

表1 各組大鼠24h尿蛋白比較（mg，±s）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與治療前比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

只數(shù)組別絞股藍(lán)總皂苷高劑量組絞股藍(lán)總皂苷中劑量組絞股藍(lán)總皂苷低劑量組纈沙坦組模型組正常對照組8 8 8 8 8 8治療前95.29±25.42##97.87±24.37##94.37±22.08##96.96±13.26##96.98±19.94##17.71±5.68治療28天后77.04±16.63##*△76.30±19.53##*△104.78±20.70##77.05±32.26##*△110.56±46.88##21.17±5.08

3.2 腎功能指標(biāo)比較 各組大鼠內(nèi)生肌酐清除率較正常對照組明顯下降（P＜0.05），絞股藍(lán)總皂苷低劑量組、模型組兩組之間無差異（P＞0.05），絞股藍(lán)總皂苷高、中劑量組和纈沙坦組明顯高于模型組（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠內(nèi)生肌酐清除率比較（±s）

表2 各組大鼠內(nèi)生肌酐清除率比較（±s）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

只數(shù)組別絞股藍(lán)總皂苷高劑量組絞股藍(lán)總皂苷中劑量組絞股藍(lán)總皂苷低劑量組纈沙坦組模型組正常對照組8 8 8 8 8 8內(nèi)生肌酐清除率（mL/min）1.47±0.24#*1.32±0.20#*1.23±0.21#1.56±0.26#*1.25±0.23#1.94±0.16

3.3 腎臟nephrin、VEGF蛋白表達(dá)比較 nephrin表達(dá)：正常對照組可見nephrin連續(xù)、線性分布在腎小球毛細(xì)血管畔足細(xì)胞側(cè)，且表達(dá)較強(qiáng)（圖1，插頁）；模型組上述陽性表達(dá)明顯減弱，且分散不均一（P＜0.01）（圖 2，插頁）；各治療組 nephrin表達(dá)較模型組表達(dá)均上調(diào)（P均＜0.01）（圖 3～6，插頁），見表 3。VEGF表達(dá)：正常對照組大鼠腎小球及腎小管均未見或少見VEGF蛋白表達(dá)顆粒（圖7，插頁）；模型組大鼠腎小球內(nèi)VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01），同時(shí)在腎小管上皮細(xì)胞也呈陽性（圖8，插頁）；各治療組大鼠VEGF表達(dá)均有一定程度的抑制（P＜0.01或P＜0.05）（圖 9～12，插頁）。其中絞股藍(lán)總皂苷高、中劑量組之間無明顯差異，見表3。

表3 各組大鼠nephrin、VEGF蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠nephrin、VEGF蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別絞股藍(lán)總皂苷高劑量組絞股藍(lán)總皂苷中劑量組絞股藍(lán)總皂苷低劑量組纈沙坦組模型組正常對照組只數(shù)8 8 8 8 8 8 nephrin表達(dá)（PI值）0.4250±0.02##**0.4138±0.03##**0.3875±0.03##**0.4400±0.01##**0.3388±0.02##0.5175±0.04 VEGF表達(dá)（PI值）0.2588±0.03##**0.2875±0.03##**0.3238±0.03##*0.2513±0.04##**0.3521±0.01##0.1350±0.04

4 討 論

足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，通過足突黏附于基底膜，與內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜共同維持正常的腎小球?yàn)V過作用。目前已證實(shí)，DN時(shí)，高糖本身、糖基化終末產(chǎn)物、氧化應(yīng)激、血管緊張素II、轉(zhuǎn)化生長因子β等多種因素作用于足細(xì)胞，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[3]。

足細(xì)胞足突間相互連接形成指狀交叉的拉鏈結(jié)構(gòu)成為裂孔，其上覆蓋著裂孔膜（SD）具有大小和電荷選擇性濾過作用。nephrin是主要的SD蛋白之一，它在腎臟特異性表達(dá)于足細(xì)胞，研究[4]證實(shí)nephrin正常表達(dá)是SD拉鏈結(jié)構(gòu)的的必要條件。研究[5]發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境抑制DM小鼠nephrin表達(dá)，并隨病程的延長抑制作用加強(qiáng)；且DN患者體內(nèi)高糖環(huán)境引起大量氧自由基積聚[6]、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）活化，這將導(dǎo)致nephrin的正常表達(dá)被強(qiáng)烈抑制，nephrin 表達(dá)降低[7-8]。

VEGF是一種增強(qiáng)血管通透性的細(xì)胞因子，參與微血管病變的病理過程。在生理情況下主要由足細(xì)胞表達(dá)和合成，病理狀態(tài)下系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞也可合成。VEGF通過與受體結(jié)合后發(fā)揮重要的生理作用：腎臟結(jié)構(gòu)的發(fā)育；維持腎小球?yàn)V過屏障功能與結(jié)構(gòu)的完整性；腎臟血管的再生與修復(fù)。而損傷的足細(xì)胞釋放大量VEGF，使得腎小球?yàn)V過膜通透性升高，最終導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生。VEGF通過影響腎小球足細(xì)胞裂SD分子而發(fā)揮抗足細(xì)胞凋亡的作用，但當(dāng)nephrin缺失時(shí)，抑制作用消失。VEGF的表達(dá)受多種因素的調(diào)控如缺氧、高糖、血管緊張素、糖基化終末產(chǎn)物等[9]。

絞股藍(lán)的主要藥效成分為絞股藍(lán)皂苷，有降血脂、調(diào)節(jié)免疫力、清除氧自由基等藥理作用。研究表明，絞股藍(lán)有一定的降血糖及改善糖尿病并發(fā)癥的作用[10]。本實(shí)驗(yàn)表明絞股藍(lán)總皂苷能上調(diào)足細(xì)胞nephrin的表達(dá)，下調(diào)VEGF的過表達(dá)，降低尿蛋白，一定程度上改善腎功能。結(jié)合本課題組既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果[11-13]可以推論絞股藍(lán)能上調(diào)SD分子nephrin表達(dá)，維持裂孔隔膜完整性，同時(shí)抑制VEGF過表達(dá)，發(fā)揮其抗足細(xì)胞凋亡作用；下調(diào)晚期糖基化終末產(chǎn)物，降低血管緊張素II受體含量，抑制轉(zhuǎn)化生長因子β過表達(dá)，從而減少足細(xì)胞損傷，降低尿蛋白。

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（收稿：2014-06-24 修回：2014-08-04）

Effect of Gypenoside on Nephrin,VEGF Expression and the Renal Function of diabetic Nephropathy Rats

WANG Yanqiu1,HUANG Ping2,DENG Min1.1 Emergency Unit,Hangzhou Red CrossHospital,Hangzhou(310003),China;2 Department of Endocrinology,Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effect of gypenoside on the expressions of nephrin,vascular endothelial growth factor（VEGF）in rats with diabetic nephropathy（DN）and to explore its mechanism underlying the reduction of proteinuria and renal protection.MethodsDN model was established by uninephrectomized and induced with streptozotocin,then randomly divided into model group and treatment groups（groups of high,medium,low dose of gypenoside,and valsartan group）,with normal rats as control group,8 rats in each group.After the treatment for 4 weeks,24-hour proteinuria and clearance of creatinine（Ccr） were determined and the expression of nephrin,VEGF protein in renal tissues was examined by immunohistochemistry.ResultsCompared with model group,the level of 24-hour proteinuria decreased （77.04±16.63mg vs 110.56±46.88mg，P＜0.05）,the Ccr increased （1.47±0.24mg vs 1.25±0.23mg，P＜0.05）,the expression of nephrin protein was upregulated（0.4250±0.02 vs 0.3388±0.22，P＜0.01），and the expression of VEGF was significantly reduced（0.2588±0.03 vs 0.3521±0.01，P＜0.01）in high-gypenoside group.The results of high-gypenoside group were similar to valsartan group.ConclusionGypenoside can reduce proteinuria,improve the renal function,and recover the expression of podocyte's associated proteins.

rats；diabetic nephropathy；podocyte；gypenoside；nephrin；VEGF

p

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2010ZB046）

1杭州市紅十字會醫(yī)院急診科（杭州 310003）；2浙江省中醫(yī)院內(nèi)分泌科（杭州 310006）

王雁秋，Tel：13666683220；E-mail：157292318@qq.com