范寰+孟繁瑞+李秀麗+任衛(wèi)科+池晶晶+李富強(qiáng)+田向?qū)W+王建國+王文杰

摘 要：以陳皮作為協(xié)同劑，采用L16（45）正交試驗(yàn)優(yōu)化其對植物乳桿菌的增殖培養(yǎng)條件，結(jié)果表明，篩選出的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度35 ℃，培養(yǎng)時(shí)間30 h，接種量為1%（V/V），培養(yǎng)基初始pH值為8，陳皮的添加量為80 g·L-1，在此條件下培養(yǎng)，活菌數(shù)為1.86×1010 cfu·mL-1。

關(guān)鍵詞：陳皮；植物乳桿菌；增殖

中圖分類號：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.08.010

植物乳桿菌作為一種益生菌因其代謝產(chǎn)物乳酸、細(xì)菌素及蛋白酶而廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中，它可以維持腸道菌群平衡，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[1-2]。 為了讓乳酸菌更好地發(fā)揮作用，人們開展了協(xié)同劑的研究。目前研究的主要有寡糖、中草藥和氨基酸。協(xié)同劑不僅能夠提高乳酸菌的生存率，延長其作用時(shí)間，使乳酸菌以更大的數(shù)量到達(dá)體內(nèi)，而且能刺激腸道內(nèi)源性及外源性乳酸菌的定植和生長，此外還能夠增強(qiáng)乳酸菌的代謝活性[3]。陳皮（Pericarpium citri Reticulatae）具有理氣健脾、燥濕化痰作用，在臨床用于胸脘脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等癥[4]。我國柑橘栽種面積居世界首位，產(chǎn)量位居世界第3。每年大量加工和消費(fèi)柑橘的同時(shí)也產(chǎn)生數(shù)量驚人的桔皮（約占果質(zhì)量的20%～25%）。而桔皮除少數(shù)用于制做中草藥（陳皮）以及飼料外，大部分被拋棄或填埋，這不僅造成了飼料資源大量浪費(fèi)，也嚴(yán)重污染了環(huán)境[5-6]。丁軻等[7]研究表明陳皮對乳酸桿菌的生長有促進(jìn)作用。

因此，本研究擬對陳皮作為一種協(xié)同劑，優(yōu)化其對植物乳桿菌體外增殖培養(yǎng)條件，為開發(fā)一種中草藥和益生菌合生元提供生產(chǎn)技術(shù)參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），天津市畜牧獸醫(yī)研究所飼料微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS液體培養(yǎng)基： 蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，檸檬酸氫二胺2 g，葡萄糖5 g，乙酸鈉2 g，吐溫80 1 g，磷酸氫二鉀2 g，七水硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水1 000 mL。

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，檸檬酸氫二胺2 g，葡萄糖5 g，乙酸鈉2 g，吐溫80 1 g，磷酸氫二鉀2 g，七水硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方 法

1.2.1 發(fā)酵條件 設(shè)計(jì)了L16（45）五個(gè)因素分別是溫度、時(shí)間、接種量、pH值和陳皮添加量的四水平正交試驗(yàn)（表1）。

按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表稱取陳皮放入三角瓶中，加入MRS液體培養(yǎng)基至100 mL，混勻后調(diào)節(jié)pH值， 121 ℃ 20 min滅菌后分別按不同的接種量加入植物乳桿菌，進(jìn)行不同發(fā)酵溫度和培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 計(jì)數(shù)方法 在1.5 mL離心管中加入900 μL無菌水，加入100 μL樣品，分別稀釋至10-5、10-6、10-7數(shù)量級，取100 μL涂平板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)3 d計(jì)數(shù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用正交設(shè)計(jì)助手專業(yè)版v3.1。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)表2因素的極差數(shù)值進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)接種量的極差數(shù)值最大，說明接種量對植物乳桿菌增殖的影響在5個(gè)考察因素中是最大的，5個(gè)因素極差大小順序依次為接種量>時(shí)間>溫度>pH值>陳皮濃度， 篩選出的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度35 ℃，培養(yǎng)時(shí)間30 h，接種量為1%，培養(yǎng)基初始pH值為8，陳皮的添加量為80 g·L-1，在此條件下培養(yǎng)，活菌數(shù)可達(dá)1.86 ×1010 cfu·mL-1。

3 結(jié)論與討論

菌體生長是一個(gè)復(fù)雜的過程，眾多因素都影響著菌體的生長狀況，如溫度、pH值、供氧強(qiáng)度、底物濃度、產(chǎn)物濃度等[8]。

培養(yǎng)基pH值對微生物的生長影響，主要是其影響菌體細(xì)胞膜電荷狀況，引起膜滲透性的變化及影響營養(yǎng)物離子化程度，從而影響菌體對養(yǎng)分的吸收[9]。每種微生物都有一個(gè)適宜的pH值范圍，而微生物細(xì)胞對pH值的改變是很敏感的，環(huán)境中的氫離子濃度如果超過了微生物的適應(yīng)范圍，就會(huì)降低抑制這些微生物的生命活動(dòng)[10]。研究表明，pH值過高或過低對植物乳桿菌的增殖都存在不利的影響，pH值的變化會(huì)引起植物乳桿菌體內(nèi)酶發(fā)生變化，從而影響細(xì)菌的生長[11]。本研究優(yōu)化后的pH值為8。

溫度高低與發(fā)酵液中的菌體生長速率、氧在培養(yǎng)液中的溶解度和傳遞速率密切相關(guān)，所以研究溫度對菌體生長的影響非常必要[12]。微生物生長是一系列復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果，而溫度的改變必然影響生物體內(nèi)進(jìn)行的許多生化反應(yīng)，菌體合成和代謝產(chǎn)物所依賴的各種酶都會(huì)受到溫度的影響，進(jìn)而影響它們的生長速率。通常，在生物學(xué)范圍內(nèi)每升高10 ℃，生長速度就加快一倍，當(dāng)超過最適生長溫度，生長速率隨溫度升高而降低[13]。尤其對大規(guī)模生產(chǎn)中研究最佳培養(yǎng)溫度需同時(shí)考慮到工業(yè)化生產(chǎn)效率。本研究最佳發(fā)酵溫度為35 ℃。

不同的接種量對菌體生長的影響不同，接種量大，菌體生長繁殖快，但后期由于營養(yǎng)缺乏，菌體衰退的也很快；接種量小，菌體前期生長慢，達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間相對滯后一點(diǎn)，但后期菌體生長良好[14]。本研究優(yōu)化后的接種量為1%。

發(fā)酵時(shí)間的長短決定了發(fā)酵是否完全，時(shí)間過短，將達(dá)不到發(fā)酵的目的；時(shí)間過長，由于受其它雜菌的作用而影響發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)。應(yīng)該根據(jù)菌種特性、培養(yǎng)基特性、發(fā)酵目的以及工業(yè)化生產(chǎn)成本等綜合因素來篩選最合理的發(fā)酵時(shí)間[15]。本研究最佳發(fā)酵時(shí)間為30 h。

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