黃國(guó)強(qiáng)　李紅　吳姚平　李慶蒙　韓順　魏賽金

摘要：以戊二酰亞胺類抗生素菌株鏈霉菌（Streptomyces）JD211為研究對(duì)象，研究其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，得出最佳培養(yǎng)基組成是甘油30 g/L、酵母膏10 g/L、硫酸銨5 g/L、NaCl 5 g/L、CaCO3 3.5 g/L。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為裝液量50 mL/250 mL，初始pH 7.0，接種量7.5%，培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為144 h。培養(yǎng)基優(yōu)化后菌絲體干重較優(yōu)化前提高了166.61%，抑菌圈提高了30.77%。

關(guān)鍵詞：鏈霉菌（Streptomyces）JD211；發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵條件；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S476+.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）10-2470-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.044

鏈霉菌（Streptomyces）JD211菌株是江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院從江西廬山珙桐樹中分離篩選得到。研究發(fā)現(xiàn)，該菌株的粗提代謝物對(duì)水稻紋枯病菌、西瓜枯萎病菌等多種植物病原真菌具有顯著的抑制效果[1]。其次生代謝物主要為戊二酰亞胺類抗生素，具有研發(fā)成新型友好生物農(nóng)藥的潛力和價(jià)值。本研究對(duì)鏈霉菌JD211培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行初步研究，以此了解該菌適宜的發(fā)酵環(huán)境，提高抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

鏈霉菌JD211、意大利青霉由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)訓(xùn)基地提供。

蔗糖馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）：蔗糖20 g，去皮馬鈴薯200 g，瓊脂20.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，甘油20.0 g，酵母膏10.0 g，碳酸鈣5.0 g，硫酸銨5.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

PDB培養(yǎng)基：去皮土豆200 g，蔗糖20 g，去離子水1 000 mL，pH自然。

高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g，KNO3 1 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

LB培養(yǎng)基[2]：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g，NaNO3 2 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

葡萄糖-天門冬酰胺液體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，天門冬酰胺0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

Bennett′s培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，N-Z酪蛋白素2 g，牛肉膏1 g，酵母粉1 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

黃豆餅粉培養(yǎng)基：玉米淀粉20 g，玉米粉20 g，蔗糖20 g，黃豆餅粉15 g，KNO3 5 g，蛋白胨5 g，KH2PO4 0.3 g，NaCl 3 g，CaCO3 5 g，豆油10 mL，去離子水1 000 mL，pH 8.0。

甘油培養(yǎng)基：甘油30 g，牛肉膏10 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，CaCO3 3.5 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備 將菌株JD211接種于PDA培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，將孢子洗下，調(diào)整孢子濃度為1×108 CFU/mL，即為種子液。

1.2.2 初始發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選 分別選取PDB培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、葡萄糖-天門冬酰胺培養(yǎng)基、Bennetts培養(yǎng)基、黃豆餅粉培養(yǎng)基、甘油培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基。確定鏈霉菌JD211發(fā)酵的初始培養(yǎng)基。初始發(fā)酵培養(yǎng)條件為：50 mL/250 mL的裝液量，10%接種量，30 ℃160 r/min培養(yǎng)7 d。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3 碳源篩選 分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、甘油替換初始培養(yǎng)基中的碳源，以不接鏈霉菌JD211但含有不同碳源的培養(yǎng)液為對(duì)照。接種量10%，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)7 d，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4 氮源篩選 分別以硫酸銨、硝酸鉀、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素替換初始培養(yǎng)基中的氮源，以不接鏈霉菌JD211但含有不同氮源的培養(yǎng)液為對(duì)照，發(fā)酵條件同碳源篩選。

1.2.5 培養(yǎng)條件的篩選 設(shè)置不同時(shí)間（12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180、192 h）、不同溫度（22、26、30、34、38 ℃）、不同裝液量（30、40、50、60、70 mL）、不同接種量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%）等條件下培養(yǎng)后，測(cè)定發(fā)酵液菌體干重和抑菌活性。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.6 優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證 對(duì)優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件與初始培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件相比較，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.7 菌體干重和抑菌活性的測(cè)定 將每種發(fā)酵液4 000 r/min離心15 min，采用菌絲干重法測(cè)定菌體的生長(zhǎng)量。發(fā)酵上清液用0.45 μm濾膜過濾除菌。除菌后，以意大利青霉為敏感指示菌，采用濾紙法[3]測(cè)定發(fā)酵液的抑菌圈，以抑菌圈直徑的大小表示發(fā)酵液的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始發(fā)酵培養(yǎng)基篩選結(jié)果

不同培養(yǎng)基的鏈霉菌JD211發(fā)酵液的菌絲體干重和抑菌活性見圖1。由圖1可知，鏈霉菌JD211在甘油培養(yǎng)基中發(fā)酵時(shí)對(duì)意大利青霉的抑菌活性最大，抑菌圈直徑為10.4 mm，菌體干重為5.96 mg/mL。綜合菌絲體干重和抑菌圈大小，選取甘油培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基進(jìn)行下一步優(yōu)化。

2.2 碳源、氮源篩選結(jié)果

碳源、氮源篩選結(jié)果見圖2。由圖2可知，供試的6種碳源中，以甘油作為碳源時(shí)，JD211菌株的菌體干重和抑菌圈均最大，分別為5.67 mg/mL、10.5 mm。蔗糖和可溶性淀粉的抑菌圈大小相同，都為10.3 mm，麥芽糖的抑菌圈最小，只有9.5 mm。因此，確定甘油為JD211菌株發(fā)酵的碳源。分別用不同的氮源替代甘油培養(yǎng)基中的氮源發(fā)酵時(shí)，酵母膏是最有利于菌株JD211生長(zhǎng)的氮源，菌體干重為13.23 mg/mL，但硫酸銨作為氮源時(shí)，發(fā)酵液抑菌活性最高，抑菌圈直徑為11.7 mm。為了進(jìn)一步提高菌株的抑菌活性，選取硫酸銨和酵母膏同時(shí)作為氮源。

2.3 發(fā)酵時(shí)間和溫度的確定

發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌效果的影響見圖3。由圖3可知，抑菌活性在144 h抑菌活性達(dá)到最大值，抑菌圈直徑為13.5 mm。菌體干重在30 ℃時(shí)達(dá)到最大值，抑菌活性最高，抑菌圈直徑為13.4 mm，這跟菌體生長(zhǎng)存在一定的關(guān)系。綜合菌體干重和抑菌活性，在后續(xù)發(fā)酵中選取培養(yǎng)溫度為30 ℃，發(fā)酵終止時(shí)間為144 h。

2.4 裝液量和接種量的確定

搖瓶裝液量、接種量對(duì)抑菌效果的影響見圖4。由圖4可知，菌絲體干重隨裝液量的增加逐漸下降，從40 mL到60 mL時(shí)下降最為明顯。裝液量為30 mL時(shí)抑菌活性最差，裝液量為30 mL至50 mL時(shí)，抑菌活性逐漸升高。抑菌活性在50 mL到70 mL時(shí)逐漸下降，說明當(dāng)裝液量過多時(shí)，溶氧減少，不利于菌株JD211的次級(jí)代謝活動(dòng)。因此，選取裝液量為50 mL/250 mL。隨著接種量的增加，菌絲體干重呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在接種量為5%時(shí)菌絲體干重最大。之后隨著接種量的增大，菌絲體干重反而減少。抑菌活性也是隨著接種量的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。接種量為7.5%時(shí)抑菌活性最大，抑菌圈直徑為13.1 mm，說明在接種量為7.5%時(shí)能獲得較好的活性產(chǎn)物，因此，選取接種量為7.5%。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

取確定碳源為30 g/L甘油、氮源為10g/L、酵母膏5 g/L硫酸銨的最適培養(yǎng)基，裝液量為50 mL/250 mL，初始pH 7.0，接種量為7.5%，在30 ℃，160 r/m條件下發(fā)酵培養(yǎng)144 h。以初始培養(yǎng)基為對(duì)照分別測(cè)定優(yōu)化前和優(yōu)化后的菌體干重和抑菌活性。結(jié)果表明，進(jìn)行培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后，菌絲體干重和抑菌活性均有了顯著提高。其中菌絲體干重提高了166.61%，抑菌圈大小提高了30.77%。

3 小結(jié)與討論

本研究通過培養(yǎng)基種類篩選、碳氮源篩選，確定了JD211菌株的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為甘油30 g/L、酵母膏10 g/L、硫氨酸5 g/L、NaCl 5 g/L、CaCO3 3.5 g/L。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：裝液量50 mL/250 mL，初始pH 7.0，接種量7.5%，培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為144 h。培養(yǎng)基優(yōu)化后菌絲體干重較優(yōu)化前提高了166.61%，抑菌圈大小提高了30.77%。

微生物的發(fā)酵受外部環(huán)境條件的影響較大，不同的環(huán)境條件往往使得微生物具有不同的生長(zhǎng)狀態(tài)和不同的代謝途徑，從而產(chǎn)生出不同的代謝產(chǎn)物[4]。通過對(duì)抗生素發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，充分發(fā)揮菌種的生產(chǎn)潛力，從而進(jìn)一步提高發(fā)酵單位[5]。本研究初步得到了適合菌株JD211生長(zhǎng)和活性物質(zhì)產(chǎn)生的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。但是，這并不一定是最佳的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。因此，菌株JD211的產(chǎn)活性物質(zhì)合成能力還有待于進(jìn)一步提高。

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