杜珊珊，王穎，張東杰

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319）

中性蛋白酶是一類在中性pH 條件下作用于蛋白質(zhì)肽鍵的蛋白酶[1]，其能將大分子蛋白質(zhì)迅速水解成肽類和部分游離氨基酸[2]，具有廣泛的市場價值，被應用于紡織、醫(yī)療、皮革、食品等行業(yè)[3-4]，但中性蛋白酶產(chǎn)量低，成本高，發(fā)酵不穩(wěn)定等，為了提高酶活性，世界各國科研工作者主要在蛋白酶基因的篩選，基因序列[5-6]，克隆表達[7]等方面進行研究。比如楊慶云等[8]用鳥槍法克隆得到嗜熱脂肪芽孢桿菌的中性蛋白酶基因，該基因表達量提高了約30 倍。茆軍等[9]成功克隆了高溫中性蛋白酶基因，并在畢赤酵母中正確表達。

此前對中性蛋白酶的研究主要集中在蠟狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，而對解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶的研究相對較少。解淀粉芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性細菌，與枯草芽孢桿菌具有很近的親緣關(guān)系[10-11]，它具有較強的胞外酶分泌能力，是淀粉酶、蛋白酶的一些主要酶制劑的生產(chǎn)菌株[12]。研究以中性蛋白酶生產(chǎn)菌株解淀粉芽孢桿菌為研究對象，利用基因工程技術(shù)對其中性蛋白酶基因進行了克隆表達，獲得了具有一定活性的中性蛋白酶。

1 材料與方法

1.1 材料

解淀粉芽孢桿菌購自中國工業(yè)菌種保藏管理中心，E.coli BL21（DE3）與質(zhì)粒PET-28a 由實驗室保存，Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ、T4-DNA 連接酶購于大連TaKaRa 產(chǎn)品，IPTG（異丙基-β-D 硫代半乳糖苷）、DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 小提中量試劑盒購自北京博大泰克生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

蛋白胨2.5 g、牛肉膏5 g、酵母膏2.5 g、葡萄糖2.5 g、氯化鈉2.5 g、瓊脂5 g、蒸餾水500 mL、pH7.0。將菌種放入培養(yǎng)基，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d[13]。

1.2.2 解淀粉芽孢桿菌總DNA 的提取

以解淀粉芽孢桿菌為材料，采用細菌基因組DNA 快速提取試劑盒，提取菌株的總DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA 的含量，在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶基因的克隆

根據(jù)Gene Bank 中報道的解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶基因序列（登錄號為：M36723.1），借助OLIGO 生物學軟件設計，并在正反向引物中添加BamHⅠ和SalⅠ酶切位點，序列如下：

正向引物：CGCGGATCCGTGGGTTTAGGTAAG AAATTG

反向引物：GCGTCGACTTACAATCCGACTGCAT TCC

通過PCR 技術(shù)擴增中性蛋白酶基因，反應體系50 μL，擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃，變性40 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，35 個循環(huán)；72 ℃后再延伸10 min。將PCR 產(chǎn)物回收純化后與PMD18-T Vector 進行連接，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，并涂布在Amp、X-Gal、IPTG 的固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)12～15 h 后進行藍白斑篩選，挑取白色菌落放進含氨芐的LB 液體培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)，送到上海生工公司進行測序，將其正確的重組質(zhì)粒命名為PMD18-T-npr，并進行同源性比較。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒PMD18-T-npr 和PET-28a 分別用BamHⅠ和SalⅠ進行雙酶切，采用試劑盒回收純化。將純化后的目的片段和PET-28a置于10 μL 反應體系中進行連接，16 ℃連接12 h，過夜培養(yǎng)，隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到E.coli BL21（DE3）中，把平板上的白斑轉(zhuǎn)化子用PCR 和雙酶切進行鑒定。

1.2.5 重組質(zhì)粒的誘導表達

將構(gòu)建成功的BL21/PET-npr 工程菌株接種于5 mL 含卡納抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于新液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8 h，此時加入IPTG（終濃度為1.0 mmol·L-1），37 ℃誘導4 h，以未誘導菌為對照。取適量的菌液在4 ℃8 000 r·min-1離心10 min，取上清液進行SDS-PAGE 分析，具體方法參照文獻[14]。

IPTG 是一種作用極強的誘導劑，能夠啟動E.coli BL21（DE3）中l(wèi)ac 啟動子的轉(zhuǎn)錄，但并不是IPTG 添加的越多就越好。

（1）按照上述的方法，選取不同IPTG 濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1）進行誘導，在37 ℃保溫2 h 后，測得酶活力進行分析。

（2）確定最佳的誘導溫度，試驗以IPTG 濃度為0.8 mmol·L-1，在不同溫度條件下（20 ℃、25 ℃、30℃、35 ℃、40 ℃）誘導2 h 后，對酶活力的影響。

（3）考察不同的誘導時間（1、2、3、4、5 h），其他條件固定不變（IPTG 濃度為0.8 mmol·L-1，溫度在30 ℃）進行誘導，確定最佳誘導條件。

1.2.6 蛋白酶活力的測定

按照標準GBT 23527-2009，將1 mL 酶液與1%酪蛋白1 mL 混合，在pH 7.5，40 ℃條件下，每分鐘反應產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需要的酶量為1 個酶活力單位（U）[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴增獲得目的片段

根據(jù)所設計的引物，以解淀粉芽孢桿菌染色體DNA 為模板，進行PCR 擴增。電泳檢測反應結(jié)果如圖1。在1 566 bp 處可見一條與預期大小相符的特異性條帶。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒PET-28a 分別用BamHⅠ和SalⅠ進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用T4DNA連接酶16 ℃過夜連接，將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞中，得到重組質(zhì)粒PET-28a/npr，挑取陽性克隆并提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證，如圖2 所示，得到一條約5 369 bp與質(zhì)粒PET-28a 大小相符，和另一條1 566 bp 與目的片段大小相符，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 Bacillus amyloliquefaciens 中性蛋白酶基因擴增電泳圖Fig.1 PCR product of npr gene in the Bacillus amyloliquefaciens

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Enzyme identification of recombinant plasmid

2.3 目的片段的測序結(jié)果

將上述重組質(zhì)粒發(fā)送到上海生工生物工程股份有限公司進行測序。得到的基因全長為1 566 bp，編碼一個由522 個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，通過BLAST軟件對中性蛋白酶核苷酸序列進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與Genebank（登錄號：M36723.1）中解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶基因序列具有100%同源性。證明重組質(zhì)粒PET-28a/npr 構(gòu)建成功。

2.4 SDS-PAGE 檢測結(jié)果

將鑒定過的陽性菌轉(zhuǎn)入含有卡納抗性的大腸桿菌中，按照試驗方法對重組子進行誘導表達，離心收集上清液，根據(jù)SDS-PAGE 進行分析，結(jié)果如圖3，經(jīng)過誘導的重組子PET-28a/npr 出現(xiàn)一條明顯特異性蛋白條帶，分子質(zhì)量約為57 kDa，該條帶大小與基因序列推導的蛋白大小相符，而未經(jīng)IPTG 誘導的重組蛋白和經(jīng)IPTG 誘導的空載體則都未出現(xiàn)此條帶，此說明解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶在大腸桿菌中得到了成功的表達。

圖3 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE 鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of the expression product by SDS-PAGE

2.5 IPTG 誘導條件的優(yōu)化

2.5.1 最佳誘導濃度的確定

如圖4 所示，隨著誘導濃度的增大，中性蛋白酶活力逐漸上升，在IPTG 濃度為0.8 mmol·L-1時酶活力達到最大，繼續(xù)加大誘導濃度，酶活力反而不高。

圖4 IPTG 濃度中性蛋白酶酶活力的影響Fig.4 Effects of concentration of IPTG on neutral protease enzyme activity

2.5.2 最佳誘導溫度的確定

溫度決定蛋白可溶性的一個重要因素，誘導溫度過高容易以包涵體形式存在，溫度過低酶活力降低，結(jié)果如圖5 所知，隨著溫度的升高，在30 ℃時酶活力達到最大值，繼續(xù)加熱不利于酶活力。

圖5 溫度對中性蛋白酶酶活力的影響Fig.5 Effects of temperature on the neutral protease enzyme activity

2.5.3 最佳誘導時間的確定

如圖6 所見，誘導1 h 后融合蛋白就有一定量的表達，隨著誘導時間的增長，中性蛋白酶酶活力緩慢升高，誘導時間在4 h 時，酶活力達到最大，而繼續(xù)誘導酶活力并沒有提高，因此最佳誘導時間為4 h。

圖6 誘導時間對中性蛋白酶酶活力的影響Fig.6 Effects of induction time on the neutral protease enzyme activity

2.6 表達蛋白的酶活性測定

將重組菌按照上述最佳IPTG 誘導條件進行培養(yǎng)，裂解細胞離心取上清液，檢測其蛋白酶活性，并做空白對照試驗，結(jié)果顯示重組大腸桿菌陽性菌的表達產(chǎn)物最高酶活力達到450 U·mL-1。

3 討論

中性蛋白酶的研究開發(fā)工作在上世紀70年代就已開始，國外最早開展基因克隆表達的有關(guān)工作，1953年Fuji[16]等從嗜熱脂肪芽孢桿菌CU21 中成功克隆了中性蛋白酶基因，并將其轉(zhuǎn)入另一菌株（MD-3）中進行表達，產(chǎn)酶量比供體菌高出15 倍。除此之外，有地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌等在內(nèi)的10 余種芽孢桿菌來源的蛋白酶基因得到了克隆表達。目前，商業(yè)上所用的中性蛋白酶大部分來源于芽孢桿菌屬，中性蛋白酶在商品酶中占有較大的份額。因此，利用基因克隆技術(shù)提高中性蛋白酶的產(chǎn)量，并對其性能進行改性，為中性蛋白酶的應用具有較好的發(fā)展前景。

試驗采用分子生物學方法，用PCR 擴增得到中性蛋白酶，利用表達載體PET-28a 在大腸桿菌中高效的表達。并采用SDS-PAGE 電泳進行分析，對誘導濃度、時間和溫度進行優(yōu)化，最高酶活性達到450 U·mL-1，在今后的試驗中還將進一步分離純化，獲得的純酶用于重組中性蛋白酶的酶學性質(zhì)及其應用的研究，這將最大化提高中性蛋白酶的產(chǎn)量和活性，為工業(yè)生產(chǎn)應用具有重要的意義。

［1］王俊，蘇國萬，趙謀明，等.產(chǎn)中性蛋白酶種曲培養(yǎng)基的優(yōu)化及酶學特性研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2012，28（8）：1002-1006.

［2］粟桂嬌，閻欲曉，陳春寧，等.雙水相萃取分離米曲霉中性蛋白酶［J］.食品科技，2012，37（1）：9-13.

［3］張樹政.酶制劑工業(yè)［M］.北京：科學出版社，1998.

［4］Pastor M D，Lorda G S，Balatti A.Protease obtention using Bacillus subtilis 3411 and amaranth seed meal medium at different aeration rates［J］.Braz.J.Microbiol，2001，32（1）：1-8.

［5］Tran L，Wu X C，Wong S L.Cloning and expression of a novel protease gene encoding an extracellular neutral protease from Bacillus subtilis［J］.Journal of Bacteriology，1991，173（20）：6364-6372.

［6］Donohue M J，Roques B P，Beaumont A.Cloning and expression in Bacillus subtilis of the npr gene from Bacillus thermoproteolyticus Rokko coding for the thermostable metalloprotease thermolysin［J］.Biochemical Journal，1994，300（2）：599-603.

［7］張紅梅，白云，魏賢斌.等.野生大豆GsRNF12 基因的克隆及表達載體的構(gòu)建［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2013，25（4）：15-17.

［8］楊慶云，江行娟，吳琳，等.嗜熱脂肪芽孢桿菌中耐熱蛋白酶基因的克?。跩］.生物工程學報，1991，7（3）：207-212.

［9］茆軍，王瑋，張志東，等.高溫中性蛋白酶基因的克隆、表達及驗證研究［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學，2008，45（5）：956-959.

［10］車曉曦，李校堃.解淀粉芽孢桿菌的研究進展［J］.北京農(nóng)業(yè)，2010（3）：7-9.

［11］Chen X H，Koumoutsi A，Scholz R，et al.Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42 ［J］.Nature Biotechnology，2007，25（9）：1007-1014.

［12］Vehmaanpera J，Steinborn G，Hofemeister J.Genetic manipulation of Bacillus amyloliquefaciens ［J］.J Biotechnology，1991，19（2-3）：221-240.

［13］朱林江，鄭飛云，趙亞洲，等.Rep -PCR 應用于快速鑒定啤酒污染菌的研究［J］.生物工程學報，2006，22（6）：1013 -1020.

［14］Teng D，Wang J H，F(xiàn)an Y，et al.Cloning of β-1，3 -1，4- glucanase gene from Bacillus licheniformis EGW039（CGMCC 0635）and its expression in Escherichia coli BL21（DE3）［J］.Appl Microbiol Biotechnology，2006，72（4）：705-712.

［15］許波，穆躍林，黃遵錫，等.中性蛋白酶基因的克隆與表達載體的構(gòu)建［J］.云南師范大學學報，2002，22（1）：47-50.

［16］Fujii M，Takagi M，Imanaka T，et al.Molecular cloning of a thermostable neutral protease gene from Bacillus stearothermophilus in a vector plasmid and its expression in Bacillus stearothermophilus and Bacillus subtilis［J］.J Bacteriollogy，1983，154（2）：831-837.