黃飛，屈飛強，任曉瓊

（黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，黃山 245041）

菠菜又稱為赤根菜、鸚鵡菜和波斯草，含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素A、B、C、磷、鐵和鈣等營養(yǎng)素物質(zhì)[1]，還含有葉綠素、胡蘿卜素和葉黃素等多種天然色素[2]，對人體具有較好的生理學(xué)作用。葉綠素是植物進行光合作用所必需的催化劑，主要以葉綠素a 和葉綠素b 兩種形式存在，葉綠素及其鈉鹽具有殺菌、除臭、解熱、止血等功能，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥衛(wèi)生和日用化學(xué)工業(yè)[3]。胡蘿卜素具有三種異構(gòu)體，其中β-胡蘿卜素除具有維生素A 的生理活性外，還具有抗氧化作用，清除體內(nèi)自由基，提高人體免疫力，延緩細胞和機體的衰老，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品及飼料添加劑等方面[4]。葉黃素是一種類胡蘿卜素，是天然的食品色素和食品營養(yǎng)劑，具有抗氧化、抗衰老和抗突變等生物活性[5]。我國菠菜資源豐富，營養(yǎng)價值高，具有較大的開發(fā)利用價值。采用超聲波輔助提取方法[6-11]對菠菜色素進行提取，通過單因素實驗和正交試驗研究了提取劑、料液比、提取溫度、超聲波功率和超聲波時間對提取效果的影響，并利用柱層析法對菠菜色素進行分離。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-2100 紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；層析柱（30×2 cm）。

1.2 原料和試劑

市售菠菜；95%乙醇，無水乙醇，丙酮，氫氧化鈉，石油醚（60～90 ℃）等均為分析純；柱層析使用200～300 目柱層析硅膠（青島海洋化工廠生產(chǎn)）。

2 實驗方法

準確稱取一定量新鮮干凈切碎的菠菜葉，置入潔凈干燥的錐形瓶中，在錐形瓶中加入一定量和一定濃度的提取劑，使之混合均勻后，把錐形瓶置于超聲波清洗器的浴槽中，一定溫度下進行超聲波震蕩提取一定時間。用循環(huán)水式真空泵將超聲震蕩后混合溶液進行固液分離，收集提取液，取0.5 mL 提取液用提取劑稀釋定容到25 mL，用紫外可見分光光度計測其λmax=430 nm 處吸光度A，根據(jù)下列公式計算菠菜色素的產(chǎn)率[12]。

C（mg·mL-1）=菠菜色素吸光度A430/吸收系數(shù)

菠菜色素的產(chǎn)率= [C（mg·mL-1）×提取液總量（mL）]/ 樣品鮮重（g）

將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，根據(jù)胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素極性不同，用柱層析法分離菠菜色素。向?qū)游鲋鶅?nèi)加入高度為1～2 cm、體積比為10∶1的石油醚-丙酮混合液作為洗脫劑，打開玻璃閥讓洗脫劑逐滴流出，當(dāng)?shù)? 個有色成分滴出時，取一潔凈錐形瓶收集，得橙黃色溶液為β-胡蘿卜素。將體積比為5∶1 的石油醚-丙酮混合液作為洗脫劑，繼續(xù)洗脫可得到第2 個色帶的棕黃色溶液為葉黃素。再將體積比為2∶1 的石油醚-丙酮混合液作為洗脫劑，可以依次得到葉綠素a（藍綠色）和葉綠素b（黃綠色）[13-15]，最終實現(xiàn)β-胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a 和葉綠素b 的分離。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實驗

3.1.1 提取劑對提取菠菜色素的影響

稱取3.0 g 新鮮干凈的菠菜葉分別置于30 mL的水、0.1%NaOH、5%NaOH、丙酮、95%乙醇、混合液A（乙醇：石油醚=3∶2，體積比）、混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，體積比）中，在室溫條件下，用超聲波清洗器處理30 min。取0.5 mL 提取液，用95%乙醇稀釋定容到25 mL，用紫外可見分光光度計測其λmax=430 nm 處吸光度A，計算菠菜色素的產(chǎn)率，實驗結(jié)果如表1 所示。

表1 不同提取劑對提取效果的影響Table 1 Effects of different extracting reagent on extraction result

由表1 可知，不同的提取劑其提取效果差異較大，混合液要比單一溶劑的提取效果好，混合液從菠菜葉片中直接提取色素效率明顯提高，這是一種協(xié)萃現(xiàn)象[16]。根據(jù)實驗結(jié)果，選擇混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，體積比）為提取劑時，提取液的吸光度最大，菠菜色素的產(chǎn)率最高，因此選擇混合液B 為提取劑效果較好。

3.1.2 料液比對提取菠菜色素的影響

稱取3.0 g 新鮮干凈的菠菜葉于錐形瓶中，分別加入9、12 、15 、18、21 mL 的混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，體積比），在室溫條件下，用超聲波清洗器處理30 min。取提取液0.5 mL，用混合液B 稀釋定容到25 mL，用紫外可見分光光度計測其λmax=430 nm 處吸光度A，計算菠菜色素的產(chǎn)率，實驗結(jié)果如表2 所示。

表2 液料比對提取效果的影響Table 2 Effects of the ratio of material to fluid on extraction result

由表2 可知，不同的料液比對提取效果有明顯 的影響。在提取過程中，當(dāng)包容固體的溶液的溶質(zhì)濃度和浸出液溶質(zhì)濃度相等時，提取達到平衡[3]。當(dāng)料液比較小時，菠菜色素浸出液的吸光度較小，產(chǎn)率較低，當(dāng)料液比為1∶5 時，吸光度達到最大，菠菜色素的產(chǎn)率最高。隨料液比的增加，菠菜色素的產(chǎn)率反而減小，因此選擇料液比為1∶5 時提取效果較好。

3.1.3 提取溫度對提取菠菜色素的影響

稱取3.0 g 新鮮干凈菠菜葉于錐形瓶中，加入15 mL 混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，體積比），保持料液比為1∶5（g·mL-1），分別在30 ℃，40 ℃，50 ℃，60 ℃，70 ℃下，用超聲波清洗器處理30 min 后，取提取液0.5 mL，用混合液B 稀釋定容到25 mL，用紫外可見分光光度計測其λmax=430 nm 處吸光度A，計算菠菜色素的產(chǎn)率，實驗結(jié)果如表3 所示。

表3 提取溫度對提取效果的影響Table 3 Effects of extraction temperature on extraction result

由表3 可知，不同的提取溫度對提取效果有明顯的影響。當(dāng)提取溫度較低時，菠菜色素浸出液的吸光度較小，產(chǎn)率較低，當(dāng)提取溫度為50℃時，吸光度達到最大，菠菜色素產(chǎn)率最高。隨提取溫度的增加，菠菜色素的產(chǎn)率反而減小。這是因為在提取過程中，隨著提取溫度的增加，菠菜色素分子擴散速度加快，提取劑能更好地溶進其分子中，使其提取效果更好，菠菜色素浸出液的吸光度增加，產(chǎn)率也增加；當(dāng)提取溫度達到一定時，提取劑在菠菜色素分子中達到飽和，不能繼續(xù)溶進其分子中，菠菜色素浸出液吸光度減小，產(chǎn)率降低，因此選擇提取溫度為50 ℃提取效果較好。

3.1.4 超聲波時間對提取菠菜色素的影響

稱取3.0 g 新鮮干凈菠菜葉于錐形瓶中，加入15 mL 混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，體積比），保持料液比為1∶5（g·mL-1），溫度為50 ℃，用超聲波清洗器分別處理15、30、45、60、75 min。取提取液0.5 mL，用混合液B 稀釋定容到25 mL，用紫外可見分光光度計測其λmax=430 nm 處吸光度A，計算菠菜色素的產(chǎn)率，實驗結(jié)果如表4 所示。

表4 超聲波時間對提取效果的影響Table 4 Effects of ultrasonic extraction time on extraction result

由表4 可知，隨著超聲波時間的增加，菠菜色素浸出液吸光度逐漸增加，產(chǎn)率也逐漸升高，當(dāng)超聲波時間為60 min 時，菠菜色素浸出液吸光度減小，產(chǎn)率降低。其原因可能是在超聲波輻射的過程中，超聲波能量直接傳遞到菠菜葉的內(nèi)部，使之瞬時加熱，溫度急劇上升。超聲輻射時間越長，溫度越高，而菠菜色素對熱的穩(wěn)定性不好，所以導(dǎo)致菠菜色素的吸光度減小[3]，產(chǎn)率降低。因此選擇超聲波時間為60 min 提取效果較好。

3.1.5 超聲波功率對提取菠菜色素的影響

稱取3.0 g 新鮮干凈菠菜葉于錐形瓶中，加入15 mL 混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，體積比），保持料液比為1∶5（g·mL-1），溫度為50 ℃，用超聲波清洗器經(jīng)過功率分別為120 W、160 W、200 W、240 W、280 W的超聲波處理60 min 后，取提取液0.5 mL，用混合液B 稀釋定容到25 mL，用紫外可見分光光度計測其λmax=430 nm 處吸光度A，計算菠菜色素的產(chǎn)率，實驗結(jié)果如表5 所示。

表5 超聲波功率對提取效果的影響Table 5 Effects of ultrasonic power on extraction result

由表5 可知，隨著超聲波功率的增加，菠菜色素 浸出液吸光度不斷增加，產(chǎn)率逐漸升高。當(dāng)超聲波功率為240 W 時，菠菜色素浸出液吸光度達到最大，菠菜色素的產(chǎn)率最高。隨著超聲波功率的繼續(xù)增加，吸光度反而減小，產(chǎn)率降低。這是因為隨著超聲功率的增加，超聲的空化作用、機械剪切的攪拌作用隨之加強，菠菜細胞充分破裂[8]。當(dāng)超聲波功率過大時，可能會引起局部溶液瞬時升溫過熱，對菠菜色素的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使菠菜色素的構(gòu)象發(fā)生改變[6]，從而影響菠菜色素的提取效果。

3.2 正交試驗設(shè)計

3.2.1 正交試驗影響因素的選擇

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，提取劑、料液比、提取溫度、超聲波提取時間和超聲波功率均會影響菠菜色素的提取，因此選取這五個因素同時作為考察因素，其實驗的影響因素和水平見表6。

表6 正交試驗因素和水平表Table 6 Factor-level of orthogonal experiment

3.2.2 正交實驗結(jié)果與討論

為了提高菠菜色素的產(chǎn)率，考察各實驗因素對提取菠菜色素的影響，進行了5 因素4 水平L16（45）正交試驗。其正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表7。

表7 L16（45）正交試驗表及結(jié)果Table 7 Results of orthogonal experimen L16（45）

表7 中的R 為各因素的極差值，極差值的大小反映了實驗因素對提取菠菜色素產(chǎn)率的影響。由極差分析結(jié)果可以看出，以提取菠菜色素產(chǎn)率為考察指標，5 種因素對提取菠菜色素產(chǎn)率的影響程度大小順序依次為：提取劑（A）＞料液比（B）＞提取溫度（C）＞超聲波功率（E）＞超聲波時間（D）；因此菠菜色素的最佳提取條件為：A4B2C3E4D1，即以乙醇與丙酮混合液（體積比為1∶1）為提取劑，料液比為1∶5（g·mL-1），提取溫度為50 ℃，超聲波時間為30 min，超聲波功率為280 W，菠菜色素的提取效果最好，其產(chǎn)率為0.187 mg·g-1。

4 結(jié)論

（1）利用超聲波輔助法提取菠菜中的色素，通過單因素實驗和正交試驗考察了提取劑、料液比、提取溫度、超聲波時間和超聲波功率對提取效果的影響，得到了提取菠菜色素工藝的最優(yōu)條件。實驗結(jié)果表明，以乙醇與丙酮混合液（體積比為1∶1）為提取劑，料液比為1∶5（g·mL-1），提取溫度為50 ℃，超聲波時間為30 min，超聲波功率為280 W，菠菜色素的提取效果最好，其產(chǎn)率為0.187 mg·g-1。超聲波輔助提取法具有提取速度快、產(chǎn)率高、節(jié)約能源、綠色環(huán)保等優(yōu)點，在天然色素的提取中具有廣闊的應(yīng)用前景。

（2）根據(jù)胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素極性不同，以不同體積比的石油醚-丙酮混合液作為洗脫劑，用層析柱法分離了菠菜色素，既能達到很好的分離效果，又能循環(huán)利用溶劑。

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