李亮亮 于德新謝棟棟 王 毅 張 濤陳 磊 張志強 丁德茂 閔 捷 鄒 慈安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科（合肥 230601）

吸煙對雄性小鼠睪丸間質細胞、睪酮及精子數量的影響

李亮亮 于德新*謝棟棟 王 毅 張 濤陳 磊 張志強 丁德茂 閔 捷 鄒 慈
安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科（合肥 230601）

摘要目的 探討吸煙對雄性小鼠的睪丸間質細胞、血清睪酮含量及附睪精子數量的影響。方法 雄性小鼠50只，隨機分為5組，即經吸煙處理后6周、12周（吸煙組），未經特殊處理的6周、12周小鼠（對照組），及吸煙6周后戒煙6周（戒煙組）小鼠。對5組小鼠睪丸組織進行HE染色，光鏡下觀察支持細胞、間質細胞形態(tài)及結構；免疫組化方法分別計數5組小鼠睪丸支持細胞及間質細胞數量；利用酶聯免疫法（ELISA）測定小鼠體內睪酮含量；用石墨爐原子吸收光譜法測定血清鎘含量；同時計數附睪精子數。結果 HE染色可見吸煙6周小鼠睪丸間質細胞數量減少；吸煙12周小鼠睪丸間質細胞數量稀少甚至消失；而睪丸支持細胞數量及形態(tài)與對照組相比未見明顯改變。免疫組化發(fā)現吸煙組小鼠睪丸支持細胞數量與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。間質細胞數量隨吸煙時間延長而顯著減少（P＜0.01）；小鼠血清中睪酮水平吸煙組明顯低于對照組（P＜0.01），且隨吸煙時間的延長而下降（P＜0.01）；吸煙組小鼠附睪精子計數較對照組顯著下降（P＜0.01），并且與吸煙時間呈正相關（P＜0.01）。而戒煙組中，睪丸間質細胞、血清睪酮含量、附睪精子數量3組數據都較吸煙組增高。結論 吸煙可導致睪丸間質細胞的破壞，影響體內睪酮的生成，進而導致生精障礙，而戒煙可逆轉此現象。

關鍵詞吸煙; 萊迪希細胞; 精子; 睪酮

吸煙及其對健康的危害性已經成為一個嚴重的社會問題。煙草成分復雜，其煙霧中有多達3 000余種已被確定為有毒物質，包括多環(huán)芳香族化合物、芳香胺等，煙霧中含有的一氧化碳、尼古丁、焦油等通過呼吸道進入體內可造成人體多系統(tǒng)的損害。另外鎘、氰、鉛、鋰等相關的有毒元素，對人體的健康均產生不可逆的影響。目前相關研究已經證明吸煙是引發(fā)癌癥、高血壓、冠心病、腦中風、肺氣腫等疾病的重要因素。除此之外，吸煙對男性生殖功能的影響及危害也被廣泛研究，但吸煙對男性生殖影響的機制還不十分清楚。本研究以經吸煙處理的雄性小鼠為實驗對象，就吸煙對小鼠睪丸間質細胞、睪酮水平及精子數量的影響進行探討。

材料與方法

一、實驗動物

雄性BALB/c小鼠50只（購自南京醫(yī)科大學動物實驗中心），體質量18～22g，鼠齡6～8周，隨機分組：（1）為吸煙6周組、（2）吸煙12周組，這兩組為吸煙組，是在在28升的塑料盒中，通過文丘里閥連接一支點燃的香煙，將吸入的煙霧與旋片式真空隔膜泵抽入的空氣混合，進行煙霧暴露（盒內的總懸浮顆粒物濃度為80mg/m3），每天暴露6h，分別持續(xù)6周和12周；（3）為對照6周組、（4）對照12周組，這兩組為對照組，未經特殊處理，與吸煙組飼養(yǎng)條件相同，分別暴露于過濾后的空氣中6周和12周；（5）為吸煙組：經吸煙6周處理后，繼續(xù)予普通喂養(yǎng)6周。

二、主要儀器及試劑

光學顯微鏡NIKON（日本）；血細胞計數器；酶聯免疫試劑盒（購自北京北方生物技術研究所）；β-HSD多克隆抗體（購自北京博奧森生物工程有限公司）；SOX9多克隆抗體（購自Abcam公司）。

三、動物處理

用頸椎脫臼法處死小鼠，直視下進行心臟采血mL，4℃下2 150×g，離心15min，分離血清置于1.0mlEP管中-20℃保存。同時剪開腹腔，分離并摘取睪丸和附睪，用微量電子天平分別稱量睪丸并記錄，一側睪丸置于中性福爾馬林液中固定，石蠟包埋，制成6μm連續(xù)切片；另一側睪丸保存于-80℃冰箱中備用。

四、睪丸組織病理學檢查

石蠟切片經二甲苯、梯度酒精脫蠟后，蘇木精染色5min，再經鹽酸酒精分化，自來水浸泡后，伊紅染色2min，再脫水，透明及中性樹脂封片，觀察睪丸形態(tài)結構的變化。

五、免疫組化染色

石蠟切片經二甲苯及梯度酒精脫蠟,蒸餾水洗3 次, 置PBS中10min,放入檸檬酸修復液中96℃10min,冷卻至室溫后用TBS、TBST各洗5min，3%雙氧水處理10min，TBS中洗3次，滴加BDT（3%BSA和10%驢血清溶于TBS）40μL，封口膜封閉30min，甩去多余液體不洗，加稀釋的一抗（1:100）4℃過夜，TBS 洗3次，每次10min，滴加過氧化物酶偶聯的的二抗20μL（兔，鼠雙標）室溫15min，TBS 洗3 次, 每次10min，滴加DAB顯色,PBS中泡洗2min兩次，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯泡洗20min后，中性樹脂封片。

六、血清睪酮（T）測定

采用酶聯免疫法檢測小鼠血清中睪酮含量，將小鼠處死后心臟所采血靜置30min，待血漿凝固后離心15min分離血清保存,按照酶聯免疫試劑盒內說明書進行操作，測得血清睪酮含量。

七、血清鎘（CdCd）含量測定

小鼠眼血于室溫下放置 2.5h，以 2 150×g的轉速離心 15min，取上層血清置于1.5mL離心管中，于-80℃冰箱保存。測量前用 1%硝酸稀釋，同時以1%硝酸作為試劑空白。利用石墨爐原子吸收分光光度計，采用兩步干燥、斜坡升溫方式測定小鼠血清鎘含量。

八、附睪精子計數

將摘取的雙側附睪立即放入盛有PBS的培養(yǎng)皿中，用眼科剪將附睪剪成一塊（1mm），轉移至含有1mL平衡液的離心管中，37℃孵育30min后，靜置制得精子懸液，利用血細胞計數器計數。

結 果

一、HEHE染色結果

光鏡下觀察HE染色切片，對照組睪丸間質細胞在生精小管間集落聚集，呈菱形或三角形，細胞較大且胞漿豐富；細胞核呈圓形或卵圓形，核內染色質呈均勻分布。吸煙6周的小鼠睪丸組織中，睪丸間質仍呈簇分布，細胞數目較對照組減少，細胞多呈圓形或卵圓形且較正常組縮小，胞漿減少。吸煙12周小鼠睪丸組織中，睪丸間質細胞數目明顯減少甚至消失，胞質濃縮，細胞核皺縮。而附著于生精小管基膜上的睪丸支持細胞的數量及形態(tài)在對照組與實驗組未見明顯差異，見圖1。

二、免疫組化結果

光鏡下觀察免疫組化切片，可以發(fā)現吸煙組中被SOX9標記的睪丸支持細胞數量與對照組及戒煙組相比無明顯差異。而吸煙組被3β-HSD抗體標記的睪丸間質細胞數量較對照組減少，吸煙12周組減少顯著；戒煙組的睪丸間質細胞數量較吸煙組增加。400倍光鏡下，每張切片隨機選擇5個不同視野，采用雙盲法計數睪丸支持細胞及間質細胞，結果見圖2和圖3。

如表1所示，吸煙6周、12周小鼠睪丸支持細胞數量與對照組小鼠相比P＞0.05，吸煙12周小鼠睪丸支持細胞數量與吸煙6周小鼠相比P＞0.05; 吸煙6周、12周小鼠睪丸間質細胞數量與對照組小鼠相比P＜0.01；吸煙12周小鼠睪丸間質細胞數量與吸煙6周小鼠相比P＜0.01。戒煙6周小鼠睪丸支持細胞數量與吸煙6周及12周小鼠相比P＞0.05；戒煙6周小鼠睪丸間質細胞數量與吸煙6周及12周小鼠相比P＜0.01。

三、吸煙對小鼠體內睪酮水平的影響

如表2所示，吸煙6周、12周小鼠與對照組小鼠相比P＜0.01；吸煙12周小鼠與吸煙6周小鼠相比P＜0.01；戒煙6周小鼠與吸煙6周小鼠相比P＞0.05；戒煙6周小鼠與吸煙12周小鼠相比P＜0.01。

四、吸煙對小鼠體內鎘含量的影響

如表3所示，吸煙6周、12周小鼠與對照組小鼠相比P＜0.01；吸煙12周小鼠與吸煙6周小鼠相比P＜0.01。

圖1 吸煙對小鼠睪丸組織學的影響

圖2 吸煙對小鼠睪丸支持細胞的影響

圖3 吸煙對小鼠睪丸間質細胞的影響

表1 吸煙對小鼠睪丸支持細胞及間質細胞的影響（x±sxs）

表2 吸煙對小鼠體內睪酮水平的影響（x±sxs）

表3 吸煙對小鼠體內鎘含量的影響（x±sxs）

五、吸煙對小鼠精子數量的影響

如表4所示，吸煙6周、12周小鼠與對照組小鼠相比P＜0.01；吸煙12周小鼠與吸煙6周小鼠相比P＜0.01；戒煙6周小鼠與吸煙6周小鼠相比P＞0.05，與吸煙12周小鼠相比P＜0.01。

表4 吸煙對小鼠附睪內精子數量的影響（xx±ss）

討 論

近年來，全球不育的發(fā)病率明顯升高。世界衛(wèi)生組織認為，不孕不育癥將成為21世紀僅次于腫瘤和心血管疾病的第三大疾病。據調查研究報告，全世界約有12%～20%的已婚夫婦面臨不孕不育的困擾，其中男性因素約占50%。我國男性不育患者高達5000萬人。引起男性不育的病因主要有性功能障礙、精索靜脈曲張、生殖道感染、免疫性因素、先天性發(fā)育異常及后天性疾病等，但是仍有高達60%～75%的患者找不到具體原因，稱為特發(fā)性男性不育。其中，吸煙作為引起男性不育的一個重要因素，近年來越來越被國內外所重視。

睪丸是男性生殖器官中產生精子的唯一場所，成年雄性動物體內的生精過程是睪丸中間質細胞、支持細胞與生精細胞共同作用的結果，因此3種細胞中任一種細胞的過度破壞都將導致生精障礙。

睪丸間質細胞是成年雄性動物體內產生睪酮的主要場所[1]。間質細胞對機體的影響主要通過其分泌的睪酮來實現, 因此血清中睪酮水平的高低也可以間接反映間質細胞的功能。成年雄性哺乳動物體內睪酮可維持生精作用，促進精子的發(fā)生和成熟。吸煙對睪酮的影響已有研究[2, 3]。本實驗中吸煙組小鼠的體內睪酮水平較對照組小鼠明顯下降，而血清中鎘的水平卻較對照組明顯升高，這說明煙霧中鎘在體內的蓄積可能與睪酮水平的下降有直接關系。已有報道稱鎘在血液中的累積，會導致睪丸間質細胞形態(tài)及結構的改變，進而影響睪酮的生成[4]；另外，血清睪酮主要在間質細胞內質網和線粒體上合成，內質網上的4種主要參與睪酮合成的酶是膽固醇側鏈裂解酶（P450 SCC），3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD)，細胞色素P450α17羥化酶/C17-20-裂合酶和17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-HSD）。有研究表明，鎘在機體內的蓄積會破壞上述酶的結構與功能，導致睪酮合成的減少[5]。

機體內睪酮水平除了與單個睪丸間質細胞合成、分泌睪酮的能力相關外, 還取決于睪丸內間質細胞的數量。3β-HSD作為睪酮合成過程中的關鍵酶，被廣泛應用在間質細胞純度分析及定性定量上[6, 7]。本實驗中，通過對吸煙組及對照組小鼠睪丸組織的HE染色觀察，發(fā)現隨著吸煙時間的延長，間質細胞數量明顯減少甚至消失，同時發(fā)生變性改變。采用雙人盲法計數睪丸間質細胞[8]也發(fā)現，隨著小鼠被動吸煙時間的延長，睪丸間質細胞的數量也明顯減少。但是對于戒煙6周后的小鼠睪丸組織觀察卻發(fā)現，睪丸間質細胞的數量較吸煙組出現可逆性變化。

目前吸煙影響精子質量的確切機制仍不清楚，但睪酮分泌的減少對生精的影響有諸多報道。Kerr 等[9]通過人工撤退睪酮的方法發(fā)現，睪酮的持續(xù)缺乏會導致睪丸中生精小管生精過程的障礙。Lee等發(fā)現成年大鼠睪丸中曲細精管內液的分泌不受FSH影響，而直接受睪酮的調控，而內液在維持生精小管微環(huán)境以及輸送營養(yǎng)物質到各級生精細胞上均發(fā)揮著重要作用，因此睪酮分泌的減少會導致內液分泌障礙，進而引起生精障礙。本研究通過對吸煙組與對照組小鼠附睪中精子計數也發(fā)現，吸煙組中成年小鼠精子較對照組明顯減少，并且隨著吸煙時間的延遲，精子數量也呈明顯的下降趨勢，這可能與前述的吸煙引起的血清睪酮的降低，進而導致小鼠的生精障礙有關。

睪丸支持細胞的主要作用是為精子的發(fā)生提供物理支撐和穩(wěn)定的微環(huán)境，并促進其運送，還為它的營養(yǎng)和發(fā)育提供所需的細胞因子，不但在向生精上皮傳遞促性腺激素的過程中發(fā)揮著中樞作用，而且具有支持、營養(yǎng)、吞噬、釋放、分泌等多種功能[10]。本實驗中通過對小鼠睪丸HE染色及免疫組化研究發(fā)現，吸煙組小鼠睪丸支持細胞在數量及形態(tài)上與對照組相比無明顯差異。這可能與相鄰支持細胞的的緊密連接結構及支持細胞具有的免疫豁免作用有關。

目前，吸煙對雄性生殖系統(tǒng)的影響國內外的研究已經比較廣泛，但結論卻不盡相同[11, 12]。吸煙是成癮性過程，長時間吸煙導致的毒素在機體內累積是其致病性的關鍵。但本實驗中對戒煙6周后的小鼠睪丸間質細胞數量、血清睪酮水平及附睪精子計數的研究發(fā)現，戒煙6周組小鼠較吸煙12周組都顯著升高，說明吸煙對睪丸的生殖毒性具有可逆性。

由于人體與小鼠組織代謝的相似性，本研究中通過建立長達12周的小鼠被動吸煙模型，達到更加接近于成人的實際抽煙時間，因此實驗結果更具可信性，這也是與Ahmadnia等[13]研究結果有所差別的原因之一。另外本研究通過對睪丸間質細胞及支持細胞的免疫組化半定量分析，發(fā)現了吸煙可能作用的靶細胞為間質細胞，這為下一步研究吸煙對睪丸細胞中相關酶及蛋白表達的影響指明了方向，同時為研究吸煙引起的男性不育的針對性干擾治療奠定了基礎。此外戒煙對雄性小鼠生殖功能的恢復也在本實驗中得到了證實，因此男性吸煙的戒斷在治療男性不育方面的作用也具有十分重要的意義。

參 考 文 獻

1 Chen H, Ge RS, Zirkin BR. Leydig cells: From sterm cells to aging. Mol Cell Endocrinol 2009; 306(1-2): 9-16

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12 Trummer H, Habermann H, Haas J, et al. The impact of cigarette smoking on human semen parameters and hormones. Hum Reprod 2002;17(6):1554-1559

13 Ahmadnia H, Ghanbari M, Moradi MR, et al. Effect of cigarette smoke on spermatogenesis in rats. Urol J 2007; 4(3): 159-163

（2014-11-30收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.03.005

中圖分類號R 698.2

*通訊作者, E-mail: yudx_urology@yahoo.com.cn

Effects of smoking on leydig cells, testosterone levels and sperm counts of male mice

Li Liangliang,Yu Dexin*,Xie Dongdong,Wang Yi, Zhang Tao,
Chen Lei, Zhang Zhiqiang, Ding Demao, Min Jie, Zou Ci
Department of Urology,Second Affi liated Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230601,China Corresponding author:Yu Dexin, E-mail: yudx_urology@yahoo.com.cn

AbstractObjective To investigate effects of smoking on leydig cells,testosterone levels and sperm counts of male mice. Methodsthods Fifty male mice were divided randomly into fi ve groups including Group1 and Group2 ( mice were treated with cigarette smoking concentration for 6 weeks, 12 weeks), Group3 and Group4( mice with no special treatment), and Group5 (mice treated with cigarette smoking concentration for 6 weeks and then with no smoking concention for 6 weeks). Testis tissues of mice in five groups were stained with HE staining. The morphologic and structural changes in leydig cells and sertoli cells were observed under lightmicroscopy. The numbers of leydig cells and sertoli cells were counted by immunohistochemistry analysis. The content of testosterone in mice was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The level of serum cadmium was detected by graphite furnace atomic absorption spectrometry, and the number of epididymal sperms was counted. Resultssults Histochemistry analysis showed that the number of leydig cells decreased obviously in mice testis with 6 weeks smoking, and even disappeared in mice testis scarce with 12 weeks smoking 12. Whereas the number and form of the sertoli cells had no obvious changes as compared with that of the control groups.Immunohistochemistry analysis showed that the number of sertoli cells in the smoking groups compared with that of the control groups had no obvious difference(P＞0.05). Along with the extension of smoking time, the number of the leydig cells progressivelly decreased(P＜0.01).The level of serum testosterone in the smoking groups was sinifi cantly lower than that in the control groups(P＜0.01). In addition, it was postively correlated with the smoking time. But three sets of date in the smoking-quited group were higher than that in the smoking groups. Conclusionusion Smoking may lead to the destruction of the leydig cells, and infl uence the product of testosterone, and further resulting in spermatogenic obstacles. While quited smoking may reverse the phenomenon.

Key wordsords smoking; leydig cells; spermatozoa; testosterone