程國棟， 吳小慧， 金 珠， 張 宇， 郝 單， 仝面換， 高建軍

（蒙牛乳業(yè)（馬鞍山）有限公司，安徽 馬鞍山243000）

磺胺類藥物（SAs）是對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)藥物的總稱，是一類用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病的抗菌藥，因其抗菌譜廣和價(jià)廉、易得等特點(diǎn)，一直在獸醫(yī)臨床和畜牧業(yè)中廣泛應(yīng)用［1］。因殘留有抗生素的畜產(chǎn)品中被人類長期食用后會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生巨大危害，中國、歐盟、美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）以及日本等許多國家和監(jiān)管機(jī)構(gòu)都已經(jīng)對(duì)該類抗生素在牛奶中的殘留限量做了明確規(guī)定［2］。目前磺胺類藥物的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法［3］、高效液相色譜法［4-8］、膠體金免疫層析法［9］、凝膠滲透色譜法［10］和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［11-13］。

隨著人們生活水平的提高，人們?cè)谧非笈Ｄ虪I養(yǎng)的同時(shí)，也開始對(duì)牛奶口味有了更多的需求，由此國內(nèi)市場上孕育而生出各種口味的調(diào)制乳。2015年國內(nèi)伊利和蒙牛兩大乳品企業(yè)的財(cái)務(wù)報(bào)告顯示其2014年銷售額均突破500億人民幣，調(diào)制乳在其銷售份額中占有重要比重。然而現(xiàn)階段我國主要使用GB／T 22966-2008《牛奶和奶粉中16種磺胺類藥物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》［14］檢測牛奶中磺胺類藥物殘留。該方法檢測生乳、滅菌乳、巴氏殺菌乳等樣本時(shí)能夠獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但在檢測基質(zhì)復(fù)雜的調(diào)制乳樣本時(shí)，雜質(zhì)不能被有效地去除，提取效率低，影響了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，針對(duì)調(diào)制乳中磺胺類藥物殘留的檢測方法報(bào)道也很少，所以研究調(diào)制乳中磺胺類藥物殘留檢測方法非常有必要，也具有實(shí)際意義。乳品加工企業(yè)依據(jù)GB 19301-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)生乳》規(guī)定對(duì)牛奶中磺胺藥物殘留進(jìn)行檢測，一般遇到磺胺類藥物殘留量超標(biāo)，絕大多數(shù)是由磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶或磺胺二甲基嘧啶3種磺胺類藥物超標(biāo)造成的，故本研究主要分析上述3種磺胺類藥物。本研究成果可以作為對(duì)國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的補(bǔ)充，以保證調(diào)制乳中磺胺類藥物處于有效監(jiān)控中，為消費(fèi)者的健康提供保障。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

UPLC-TQD液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子（ESI）源（美國 Waters公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）；漩渦混合儀（德國IKA公司）；離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；氮吹儀（美國Organomation公司）；固相萃取裝置（美國SUPELCO公司）。

1.2 試劑與耗材

甲酸、乙酸（色譜純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；甲醇、乙腈（HPLC純，F(xiàn)isher公司）；磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%，DR.Ehrenstorfer公司）；HLB固相萃取小柱（60 mg，3 mL，Waters公司）；有機(jī)系濾頭（0.22 μm，Waters公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水器制備的超純水。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量的磺胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制100 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃冰箱中儲(chǔ)存。使用時(shí)先用甲醇稀釋成1 mg／L的中間液，再用陰性基質(zhì)溶液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1%乙酸水溶液：將1 mL乙酸置于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻后得到。0.1%甲酸水溶液：取0.1 mL甲酸，用水定容至100 mL，混勻后得到。20%甲醇水溶液：取20 mL甲醇，用水定容至100 mL，混勻后得到。

1.3 樣品處理與測定

1.3.1 樣品制備與保存

取均勻樣品約250 g裝入潔凈容器作為試樣，標(biāo)明標(biāo)記，密封至4℃下保存。

1.3.2 樣品提取

稱取2 g（精確到0.01 g）待測調(diào)制乳樣品于50 mL離心管中，加入4 mL 1%乙酸水溶液，置于漩渦混合儀上高速漩渦2 min；再加入12 mL甲醇，高速漩渦2 min 后離心（6 000 r／min ，8 min），取離心后的上清液于雞心瓶中備用。

1.3.3 樣品凈化

將提取液于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5 mL以下，用6 mL 1%乙酸水溶液分兩次洗滌雞心瓶，將洗液與處理好的樣品混勻，加入到已活化的HLB固相萃取柱（HLB固相萃取柱使用前依次用4 mL甲醇、4 mL水過柱）中，控制流速低于2 mL／min，待濾液全部通過后，用3 mL水淋洗并抽干HLB固相萃取柱；最后用4 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，得到凈化液。將凈化液于50℃水浴中用氮?dú)獯蹈?，再加? mL 20%甲醇水溶液，渦旋溶解后經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾，濾液供UPLC-MS／MS檢測。

1.4 UPLC－MS／MS 條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）和0.1% 甲酸水溶液（B）；流速：0.3 mL／min；梯度洗脫程序：0 ～1 min，25%A ～60%A（曲線6：線性梯度）；1～3 min，60%A（曲線6：線性梯度）；3～5 min，60%A ～25%A（曲線1：臺(tái)階梯度）。柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子化模式為電噴霧正離子（ESI+）模式；質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；電離電壓為3.00 kV；離子源溫度為120℃；去溶劑氣溫度為380℃；去溶劑氣為氮?dú)?，流量?50 L／h；碰撞氣為高純氬氣，流量為20 L／h。錐孔電壓、碰撞能量及定性和定量離子等質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 3種磺胺類藥物的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters of the three sulfonamides

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇

目前常用乙腈、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷等有機(jī)溶劑或鹽酸、三氯乙酸、高氯酸等酸溶液提取牛奶中殘留的磺胺類藥物。乙腈和甲醇均能很好地提取樣品中的磺胺類藥物，但乙腈沸點(diǎn)較甲醇高，提取濃縮耗時(shí)長，毒性相對(duì)較大，且乙腈提取磺胺甲惡唑的效率不如甲醇［6］。林海丹等［15］使用乙酸乙酯對(duì)樣品進(jìn)行提取時(shí)發(fā)現(xiàn)容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，提取后樣品雜質(zhì)較多，存在干擾，不適合鮮奶樣品的提取。本研究前期也曾使用乙酸乙酯對(duì)朱古力牛奶、咖啡牛奶和花生牛奶樣品進(jìn)行提取，檢測后發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯對(duì)樣本中3種磺胺藥物的提取效率偏低，磺胺嘧啶的回收率只有50%左右，磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的回收率在60%左右，說明乙酸乙酯也不適合調(diào)制乳樣品的提取。

由于磺胺類藥物呈弱堿性，增加酸性可以增大磺胺在水中的溶解性［16］。實(shí)驗(yàn)采用先加入乙酸溶液的提取方式將磺胺類藥物從牛奶中解離出來，然后用甲醇進(jìn)一步提取，在提取過程中去除樣品中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)使用1%乙酸水溶液和甲醇先后對(duì)樣品進(jìn)行提取，能夠有效地提取出樣品中的3種磺胺類藥物。

2.2 固相萃取柱的選擇

張志剛［17］曾使用0.1%乙酸乙腈溶液提取豬肉中的13種磺胺藥物，然后濃縮上機(jī)供UPLC-MS／MS檢測，取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但調(diào)制乳樣品基質(zhì)復(fù)雜，樣本種類繁多，單純地僅僅是提取、濃縮，不進(jìn)行固相萃取柱凈化，很難獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)考察了用乙腈和乙酸乙酯（4∶1，v／v）混合溶液提取樣本，然后將樣本經(jīng)過除脂、濃縮、復(fù)溶后上機(jī)檢測，結(jié)果顯示樣本的噪聲較大，加標(biāo)濃度在5 μg／kg以下時(shí)，樣本的回收率和重復(fù)性均較差，說明使用固相萃取柱對(duì)調(diào)制乳樣本進(jìn)行凈化非常必要。

目前用于磺胺類藥物檢測時(shí)使用的固相萃取柱主要有C18萃取柱、陽離子萃取小柱、氨基柱萃取柱、堿性氧化鋁萃取柱和HLB萃取柱等。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了使用C18萃取柱、HLB萃取柱和混合陽離子交換柱的凈化效果，結(jié)果顯示：使用混合陽離子萃取柱對(duì)樣本進(jìn)行凈化，以5%氨化甲醇洗脫，最終3種磺胺類藥物的回收率均低于10%，可能是1%乙酸溶液不能很好地使磺胺類藥物富集在陽離子交換小柱上；使用C18萃取柱和HLB萃取柱凈化，以甲醇洗脫，HLB萃取柱的凈化效果比C18萃取柱好。另外，楊方等［18］的研究指出，不同批次的C18萃取柱在相同條件下檢測磺胺類物質(zhì)獲得結(jié)果的重現(xiàn)性不夠理想；吳銀良等［19］采用C18柱和氨基柱組合提取牛奶中的磺胺類藥物，雖然獲得了較好的結(jié)果，但使用了2支萃取柱凈化樣品，實(shí)驗(yàn)步驟較為繁瑣，也增加了實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。因此本文最后采用HLB萃取柱作為凈化柱。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用方法中產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)的影響機(jī)制目前尚不清楚，但通常認(rèn)為共提物基質(zhì)成分與待測目標(biāo)物在色譜柱出口電離競爭是引起基質(zhì)效應(yīng)的主要機(jī)理［20］。其結(jié)果會(huì)降低或增加目標(biāo)離子的生成效率及離子強(qiáng)度，從而影響測定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。實(shí)驗(yàn)采用陰性樣品基質(zhì)溶液與流動(dòng)相分別配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同條件下進(jìn)行UPLC-MS／MS檢測。結(jié)果顯示：陰性樣品基質(zhì)對(duì)磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶具有增強(qiáng)效應(yīng)，對(duì)磺胺二甲基嘧啶具有減弱效應(yīng)。為了消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)采用陰性樣品基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液來定量調(diào)制乳中的3種磺胺類藥物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意。

2.4 流動(dòng)相的選擇

因磺胺類藥物結(jié)構(gòu)中含有-NH2，在流動(dòng)相中加入酸可以增加其離子化效率，同時(shí)pH值也對(duì)磺胺類化合物在色譜柱上的保留有重要影響。實(shí)驗(yàn)分別使用0.1%甲酸水溶液和0.1%乙酸水溶液作為流動(dòng)相做對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：加入兩種酸時(shí)，3種磺胺藥物均有很好的響應(yīng)；但以0.1%乙酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，3種磺胺類藥物的保留時(shí)間顯著提前，色譜峰不能完全分離；而以0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，3種磺胺類藥物能夠完全分離。因此本實(shí)驗(yàn)選擇以0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

配制質(zhì)量濃度分別為 1、2、5、10、20、50 和 100 μg／L的磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作液中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶進(jìn)行檢測。以定量離子的峰面積Y對(duì)其質(zhì)量濃度X（μg／L）進(jìn)行線性回歸，得到磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見表2），其線性響應(yīng)范圍完全滿足測定的要求，證明該方法定量測定的可靠性。

表2 3種磺胺類藥物的線性方程和相關(guān)系數(shù)（R2）Table 2 Linear equations and correlation coefficients（R2）of the three sulfonamides

2.6 回收率和精密度

由于目前市場上調(diào)制乳的種類繁多，實(shí)驗(yàn)僅選取朱古力牛奶、咖啡牛奶和花生牛奶3種具有代表性的調(diào)制乳產(chǎn)品進(jìn)行回收率和精密度的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

取不含磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的牛奶作為空白樣品，向空白樣品中添加1、2和10 μg／kg的磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，得到加標(biāo)樣品，按照1.3節(jié)的條件進(jìn)行樣品處理，1.4節(jié)的條件進(jìn)行測定，每個(gè)加標(biāo)水平平行測定6個(gè)樣品，3種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表3?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品空白和樣品空白加標(biāo)的磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶色譜圖見圖1。

表3 空白樣品中3種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）Table 3 Recoveries and RSDs of the three sulfonamides spiked in blank samples（n＝6）

圖 1 （a）陰性基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（20 μg／L）、（b）空白調(diào)制乳樣品和（c）加標(biāo)調(diào)制乳樣品（1 μg／kg）的色譜圖Fig.1 Chromatograms of（a）a mixed standard working solution in negative matrix （20 μg／L），（b）a blank modified milk sample and （c）a spiked modified milk sample （1 μg／kg）

2.7 檢出限

檢出限（LOD）和定量限（LOQ）是任何方法論證的重要組成部分，國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）對(duì)檢出限的定義為某特定方法在給定的置信度內(nèi)可從樣品中檢出待測物質(zhì)的最小濃度或量。LOD和LOQ受分離條件的影響非常顯著，如色譜柱、試劑，尤其是儀器與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。儀器的改變，尤其是泵系統(tǒng)和檢測器，或使用被污染的試劑將使信噪比產(chǎn)生較大的變化（尤其影響基線噪聲和漂移）。

首先用陰性基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后按照UPLC-MS／MS條件對(duì)該工作液進(jìn)行檢測，算出3種磺胺類藥物理論上的檢出限（S／N=3時(shí)的濃度）和定量限（S／N=10時(shí)的濃度），結(jié)果見表4。檢測過程中受前處理操作等因素的影響，往往方法的定量限與理論上的定量限有所差異，宋偉等［21］指出定量限為在獲得滿意的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差條件下可以檢測到的樣品溶液中目標(biāo)化合物的最低濃度。實(shí)際檢測過程中添加3種磺胺類藥物的濃度為1 μg／kg時(shí)，回收率和精密度均取得較為滿意結(jié)果，因此將1 μg／kg作為方法的定量限。

表4 UPLC－MS／MS測定調(diào)制乳中3種磺胺類藥物的檢出限和定量限Table 4 LODs and LOQs for the three sulfonamides in modified milk by UPLC－MS／MS

3 結(jié)論

調(diào)制乳經(jīng)乙酸水溶液和甲醇提取、沉淀蛋白質(zhì)，提取液經(jīng)HLB固相萃取柱凈化、甲醇洗脫，UPLCMS／MS測定，外標(biāo)法定量。實(shí)驗(yàn)方法簡便、快速、準(zhǔn)確、實(shí)用，結(jié)果令人滿意，適用于調(diào)制乳中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的確證檢測。

此外，GB／T 22966-2008中其他13種磺胺類藥物也能有效地被1%乙酸水溶液和甲醇提取，本文建立的方法在固相萃取柱的選擇、樣品的富集和洗脫方面和GB／T 22966-2008方法類似，作為對(duì)國家標(biāo)準(zhǔn)方法的補(bǔ)充，也可以用于調(diào)制乳中其他13種磺胺類藥物的檢測。

［1］ Xu G W，Kong X H，Li J H，et al.Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica（徐國偉，孔祥虹，李建華，等.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)），2008，17（1）：42

［2］ Wan C H，Long Z X.Modern Scientific Instruments（萬春花，龍洲雄.現(xiàn)代科學(xué)儀器），2008（2）：99

［3］ Wang W H，Han Z J，Wei X J，et al.Journal of Anhui Agricultural Sciences（王偉華，韓占江，魏新軍，等.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)），2006，34（6）：1101

［4］ Huang D M，Huang X Y，Gu R R，et al.Chinese Journal of Chromatography（黃冬梅，黃宣運(yùn)，顧潤潤，等.色譜），2014，32（8）：874

［5］ Liu J H，Sun Z Z，Huang X L，et al.Chinese Journal of Chromatography（劉菁華，孫振中，黃雪玲，等.色譜），2015，33（4）：434

［6］ Li X D，Xian Q M，Liu H L，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry（李學(xué)德，鮮啓明，劉紅玲，等.分析化學(xué)），2010，38（3）：429

［7］ Zhao H X，Liu H P，Yan Z Y.Chinese Journal of Chromatography（趙海香，劉海萍，閆早嬰.色譜），2014，32（3）：294

［8］ Wu C Q，Lei J M，Li Y L，et al.Chinese Journal of Chromatography（吳翠琴，雷金妹，李韻靈，等.色譜），2014，32（12）：1362

［9］ Han J，Liu E M，Wang S，et al.Modern Food Science and Technology（韓靜，劉恩梅，王帥，等.現(xiàn)代食品科技），2011，27（5）：603

［10］ Ouyang Y L，Xie W P，Huang Y Y，et al.Chinese Journal of Public Health（歐陽燕玲，謝維平，黃盈煜，等.中國公共衛(wèi)生），2009，25（5）：610

［11］ Ma Q，Yu Q W，Luo Y B，et al.Chinese Journal of Chromatography（馬喬，余瓊衛(wèi)，羅彥波，等.色譜），2011，29（7）：624

［12］ Yan C R，Zhang X Q，Lin H，et al.Meat Research （顏春榮，張曉強(qiáng)，林慧，等.肉類研究），2013，27（10）：17

［13］ Gong S S，Gu X，Cao H，et al.Journal of Instrumental Analysis（貢松松，顧欣，曹慧，等.分析測試學(xué)報(bào)），2014，33（12）：1342

［14］ GB ／T 22966-2008

［15］ Lin H D，Xie S X，F(xiàn)eng D X，et al.Journal of Instrumental Analysis（林海丹，謝守新，馮德雄，等.分析測試學(xué)報(bào)），2003，22（1）：94

［16］ Sun J W，Zhao X H.Food Science（孫晶瑋，趙新淮.食品科學(xué)），2007，28（6）：256

［17］ Zhang Z G.Meat Research（張志剛.肉類研究），2013，27（2）：13

［18］ Yang F，Li Y P，Qian J，et al.Analysis and Testing Technology and Instruments（楊方，李耀平，錢疆，等.分析測試技術(shù)與儀器），2004，10（4）：234

［19］ Wu Y L，Zhao L，Liu Y J，et al.Chinese Journal of Chromatography（吳銀良，趙莉，劉勇軍，等.色譜），2007，25（5）：728

［20］ Wang L Q，He L M，Zeng Z L，et al.Journal of Chinese Mass Spectrometry Society（王立琦，賀利民，曾振林，等.質(zhì)譜學(xué)報(bào)），2011，32（6）：321

［21］ Song W，Hu Y Y，Han F，et al.Chinese Journal of Chromatography（宋偉，胡艷云，韓芳，等.色譜），2013，31（12）：1161