劉小勤， 佟 玲， 孟文婷， 孫國祥*

（1.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽110016；2.天士力控股集團研究院藥物分析所，天津300402）

我國是中藥材種植大國，然而我國在世界中藥資源市場上的占有額不高，由環(huán)境污染（如農(nóng)藥殘留）引起的藥材質(zhì)量問題是主要原因之一。隨著國際農(nóng)藥殘留限量標準日趨嚴格，如歐盟針對植物藥中70類農(nóng)藥（包括異構(gòu)體及毒性代謝產(chǎn)物）進行了嚴格的限量規(guī)定［1］，對于沒有登記使用的農(nóng)藥按照一律限量標準（0.01 mg／kg）執(zhí)行，而多數(shù)發(fā)展中國家的檢測技術(shù)難以達到這一水平，這無疑為中藥材出口增加了難度。因此，建立快速、簡便、靈敏度高的分析方法對中藥材中多種農(nóng)藥殘留量進行監(jiān)測具有十分重要的現(xiàn)實意義。

白芍是我國常用的傳統(tǒng)中藥，為毛茛科植物，以根入藥。白芍在種植過程中易感染多種病蟲害且發(fā)病率高，濫用農(nóng)藥造成了白芍的直接污染，此外，白芍生長周期長（一般3～4年［2］），土壤和空氣中殘留的農(nóng)藥容易在植物組織中富集，又會對白芍產(chǎn)生間接污染［3］。然而，目前針對白芍中農(nóng)藥多殘留缺乏系統(tǒng)性的研究，2010年Gao等［4］采用氣相色譜法測定了白芍中檢出率較高的20種農(nóng)藥殘留，雖然方法靈敏度高，但電子捕獲檢測器缺乏選擇性，在實際樣品測定過程中容易產(chǎn)生假陽性；同年，林建［5］研究了多菌靈和三唑酮在杭白芍中的消解動態(tài)和殘留行為，但該研究僅涉及上述兩種農(nóng)藥，應(yīng)用性不強；2013年汪佳鳳等［6］采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了白芍中10種有機磷農(nóng)藥殘留量，但檢測指標覆蓋不全，難以對白芍中多種農(nóng)藥殘留進行全方位監(jiān)控。其他的文獻報道［7-9］也普遍存在以上問題。綜上，目前對白芍中多種農(nóng)藥殘留量的監(jiān)控缺乏切實有效的分析方法，難以為白芍的臨床應(yīng)用提供安全性保障。

本文根據(jù)歐盟對植物藥制定的農(nóng)藥殘留檢測項目，針對白芍受農(nóng)藥污染情況和其基質(zhì)復(fù)雜的特點，利用NH2固相萃取凈化技術(shù)，同時結(jié)合三重四極桿質(zhì)譜儀選擇性高、抗干擾能力強的特點，建立了99種農(nóng)藥同時測定的分析方法。用基質(zhì)匹配標準曲線內(nèi)標法進行定量，對基質(zhì)效應(yīng)進行了補償。該方法靈敏度高、準確性好，滿足白芍中農(nóng)藥殘留檢測的要求，同時也為其他根類藥材的多農(nóng)藥殘留檢測提供借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

GCMS-TQ8030型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本SHIMADZU公司），配AOC-20i+s型自動進樣器；CF16RN型高速微量離心機（日本HITACHI公司）；R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；HZS-H型水浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國 Millipore公司）；XS105型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純（德國Merck公司）；實驗用水為Milli-Q超純水系統(tǒng)所制超純水；NH2固相萃取柱（500 mg／6 mL）、CARB／PSA 固相萃取柱（500 mg／500 mg／6 mL）和C18固相萃取柱（500 mg／6 mL）均為 DIKMA科技公司生產(chǎn)；無水硫酸鈉為優(yōu)級純（天津市光復(fù)精細化工研究所）；醋酸鈉為分析純（天津市化學(xué)試劑一廠）；99種農(nóng)藥標準品購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心和德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度大于95%；以丙酮配制成質(zhì)量濃度為100～1 000 mg／L的各農(nóng)藥標準儲備液，再準確量取一定體積的各農(nóng)藥標準儲備液，用丙酮定容，得到質(zhì)量濃度為2 mg／L的99種農(nóng)藥混合標準溶液，于-18℃下避光保存。

白芍藥材購于亳州中藥材市場，產(chǎn)地：安徽。

1.2 樣品前處理

取白芍藥材，粉碎。取粉末4.0 g，精密稱定，置于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入10 mL水浸潤30 min。用移液管準確加入20 mL乙酸乙酯，超聲處理30 min，向離心管中加入4 g無水硫酸鈉和1 g醋酸鈉，渦旋振搖2 min，以10 000 r／min的速度離心3 min，取上清液10 mL于150 mL圓底燒瓶中，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用2 mL二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）溶解，待凈化。

用3 mL 二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）預(yù)淋洗固相萃取小柱，將待凈化液轉(zhuǎn)移至柱中，用15 mL二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）分 3次淋洗小柱。流出液全部收集于100 mL雞心瓶中，于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用2 mL丙酮復(fù)溶，待 GC-MS／MS測定。

1.3 混合標準工作溶液的配制

向5 mL量瓶中加入適量氘代毒死蜱-D10（內(nèi)標）溶液及混合標準溶液，用1.2節(jié)所述提取凈化后的空白樣品液定容至刻度。得到質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、50、100、200、250 μg／L 基質(zhì)匹配標準工作溶液，其中內(nèi)標溶液的質(zhì)量濃度均為50 μg／L。

1.4 GC－MS／MS 條件

GC條件 InertCap 5MS／HP氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm；日本 SHIMADZU 公司）；載氣：氦氣（純度≥99.999%），流速為 1.69 mL／min；進樣口溫度為 250 ℃；進樣量 1.0 μL，不分流進樣；升溫程序：50℃保持1 min，以25℃／min的速度升溫至125℃，再以10℃／min升溫至300℃，保持1.5 min，總運行時間為25 min。

MS條件 電子轟擊電離源（EI源）電壓為70 eV；離子源溫度200℃；接口溫度250℃；溶劑延遲時間2.8 min；碰撞氣：氬氣（純度≥99.999%）；島津GC Solution工作站。

1.5 基質(zhì)效應(yīng)的評價

按照美國臨床實驗室標準化委員會的定義，基質(zhì)效應(yīng)指樣品中除目標分析物以外的其他成分對待測物測定值的影響，即基質(zhì)對分析方法準確測定分析物能力的干擾［10］?；|(zhì)效應(yīng)的存在能增強或抑制組分的信號響應(yīng)值［11］。為了準確評價白芍基質(zhì)對測定結(jié)果準確度的影響，本文同時選取兩組分別由溶劑和空白基質(zhì)溶液配制的混合標準工作溶液，GC-MS／MS測定后，繪制標準工作曲線，按下式［12］計算基質(zhì)效應(yīng)（MF）：

其中，S溶劑指溶劑混合標準工作溶液的線性方程斜率；S基質(zhì)指基質(zhì)匹配標準工作溶液的線性方程斜率。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC－MS／MS 分析參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1 產(chǎn)物離子的選擇

在多農(nóng)藥殘留分析中，一般判別樣品是否有農(nóng)藥檢出需滿足兩個條件：首先是目標組分與對照品的保留時間相吻合；第二是在一定誤差允許范圍內(nèi)，目標組分與對照品的離子比率值無顯著性差異。因此，在確定質(zhì)譜參數(shù)時，定量離子和定性離子的選擇尤其重要。如果對照品中的產(chǎn)物離子受到背景信號的干擾將會嚴重影響定性、定量結(jié)果的準確性。如氯氟氰菊酯的兩個同分異構(gòu)體中，當前體離子為m／z 197時，定性離子m／z 91受化學(xué)背景干擾大，噪聲明顯，而定性離子m／z 141的信號響應(yīng)強，峰形正常，在掃描時間窗內(nèi)無干擾信號（見圖1），因此將m／z 141作為氯氟氰菊酯的特征定性離子。

2.1.2 碰撞電壓的優(yōu)化

在三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測定過程中，一般選取m／z大、信號響應(yīng)強的離子（如基峰）作為前體離子，產(chǎn)物離子則選擇前體離子裂解的特征性碎片，即第三個四極桿（Q3）允許通過的穩(wěn)態(tài)離子。本研究分別通過全掃描模式（Q3 scan）和碎片離子掃描模式確定目標組分的前體離子及特征產(chǎn)物離子，然后對前體離子生成產(chǎn)物離子過程中所必需的碰撞氣（CID，氬氣）的碰撞電壓（即產(chǎn)物離子獲得最高響應(yīng)值時的碰撞能）進行優(yōu)化，以確定最終的MRM質(zhì)譜參數(shù)。圖2表示在不同碰撞電壓的誘導(dǎo)解離作用下，敵敵畏和殺螟硫磷3組離子對的響應(yīng)趨勢圖，各曲線的最高點所對應(yīng)的橫坐標即代表產(chǎn)物離子響應(yīng)最高時的作用電壓。各農(nóng)藥組分質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果見表1。

圖1 氯氟氰菊酯異構(gòu)體不同定性離子的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of different qualitative ions of cyhalothrin isomers

圖2 不同碰撞電壓下敵敵畏和殺螟硫磷3組產(chǎn)物離子的響應(yīng)值Fig.2 Response values of three product ions of dichlorvos and fenitrothion under different collision voltages

表1 99種農(nóng)藥及內(nèi)標的保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Retention times and GC－MS ／MS conditions of the 99 pesticides and internal standard

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

由于本研究選取的農(nóng)藥種類多，極性相差較大，因此在考察提取溶劑時選取了3種極性適中的溶劑，分別為乙腈、乙酸乙酯和丙酮。在空白白芍基質(zhì)中添加0.10 mg／kg的99種農(nóng)藥及內(nèi)標，按1.2節(jié)前處理步驟平行操作3份，對提取效率進行比對。實驗結(jié)果表明，當采用丙酮提取時，回收率較乙酸乙酯和乙腈低，但3組結(jié)果不存在顯著性差異，基本滿足回收率要求。樣品在提取前用水浸泡時間較長，此時農(nóng)藥組分已基本從植物組織中釋放出來，因此乙腈和乙酸乙酯均能較好的提取目標組分，因乙腈毒性較大，綜合考慮，最終選取乙酸乙酯為提取溶劑。

2.2.2 SPE柱凈化效果的比較

白芍基質(zhì)復(fù)雜，主要含有單萜及單萜苷類、鞣質(zhì)和黃酮類等成分［13］，色素含量較少。在進行農(nóng)藥殘留分析時，供試品溶液往往需要經(jīng)過適當?shù)姆椒▋艋?，否則難以獲得準確的分析結(jié)果。本研究選取3種常用的固相萃取小柱，分別為 NH2柱、CARB／PSA柱和C18柱，按1.2節(jié)下進行前處理操作，圖3為加標水平為0.05 mg／kg時各物質(zhì)的回收率試驗結(jié)果（n=3）。99種物質(zhì)經(jīng)3種小柱凈化后回收率略有差異，其中NH2柱平均回收率為70%～120%的農(nóng)藥比例最高，達 97.0%，CARB／PSA柱（85.9%）次之，C18柱（82.8%）最低。

圖3 3種固相萃取小柱的凈化效果比較Fig.3 Comparison of purification effects of three solid－phase extraction columns

NH2和CARB／PSA的凈化機理類似，其與雜質(zhì)之間均存在極性相互作用和弱陰離子交換作用，對鞣酸和萜類等物質(zhì)具有強吸附能力。雖然CARB／PSA中的石墨化碳還兼具吸附色素的功能，但是其特征性的正六元環(huán)結(jié)構(gòu)，對平面型化合物如六六六、五氯硝基苯和四氯硝基苯等具有極強的親和力，導(dǎo)致這些物質(zhì)的回收率普遍偏低。此外，抑菌靈和硫丹硫酸酯經(jīng)過CARB／PSA柱凈化后，幾乎檢測不到其色譜峰。C18屬于非極性填料，甲胺磷極性較大，理論上不能被C18吸附，但在C18柱的流出液中并未檢測到該化合物。因此，綜合考慮方法性能，最終選擇NH2作為前處理凈化材料。

2.2.3 淋洗液及用量考察

圖4 99種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effects of the 99 pesticides

參考農(nóng)業(yè)標準NY／T 761-2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》［14］，采用二氯甲烷以及不同比例的二氯甲烷-甲醇（體積比分別為 100∶1、100∶2、100∶3 和100∶4）混合溶劑分別淋洗氨基柱。以回收率為評價指標，結(jié)果表明，混合溶劑較單一溶劑效果好，可能是由于甲醇的加入能有效增強淋洗液的極性，使得極性較大的農(nóng)藥（如有機磷類農(nóng)藥）回收率顯著增加。由于不同配比的淋洗液效果相當，考慮到淋洗液極性增強，共流出雜質(zhì)增多，因此最終選擇以二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）作為淋洗液。同時對淋洗液的用量進行了考察，當淋洗體積為15 mL時，各組分的回收率均滿足要求。最終確定采用15 mL二氯甲烷-甲醇（100∶1，v／v）淋洗氨基柱。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

由基質(zhì)引起的信號增強或減弱效應(yīng)在農(nóng)藥殘留氣相色譜分析中是非常常見的［15］，基質(zhì)效應(yīng)的存在對定量的準確性和重復(fù)性具有一定的影響［16，17］，白芍成分復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)不可忽視。本文用溶劑和空白基質(zhì)溶液配制的標準曲線的斜率比值來表征基質(zhì)效應(yīng)的大小，圖4為99種農(nóng)藥在白芍基質(zhì)中表現(xiàn)出的基質(zhì)效應(yīng)，當MF的值為正或者負時，代表基質(zhì)增強或者抑制作用，當MF的值為0時，表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。由圖4可知，各物質(zhì)普遍表現(xiàn)為基質(zhì)增強作用，抑菌靈的增強效應(yīng)最大，為60%。環(huán)氧七氯A、高效氯氟氰菊酯和溴氰菊酯表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。值得注意的是，環(huán)氧七氯和氯氟氰菊酯均存在同分異構(gòu)現(xiàn)象，各異構(gòu)體在色譜柱中的保留行為不同，具體表現(xiàn)為保留時間的微小差異（＜0.21 min），但基質(zhì)效應(yīng)的趨勢卻完全相反，這一現(xiàn)象可能是由于基質(zhì)效應(yīng)與物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)有關(guān)［18］。在99種農(nóng)藥中，59%的農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)較?。∕F介于±20%之間），97%的農(nóng)藥表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng)（MF介于±50%之間）。因此，在GC-MS／MS多農(nóng)藥殘留分析中采用基質(zhì)匹配標準溶液內(nèi)標法對基質(zhì)效應(yīng)進行補償。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性關(guān)系和定量限

在質(zhì)量濃度為0.001～0.25 mg／L范圍內(nèi)，基質(zhì)匹配標準工作溶液經(jīng)GC-MS／MS測定后，以相對峰面積（A對照品／A內(nèi)標）對相對質(zhì)量濃度 C對照品／C內(nèi)標作圖，繪制工作曲線，結(jié)果表明，響應(yīng)值和濃度之間均顯示良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99。

LOQ是指在可接受的準確性和精密度下，能夠定量測定樣品中待測成分的最低量或濃度［19］。本實驗通過向白芍空白基質(zhì)中添加多個較低水平的農(nóng)藥混合標準溶液分別進行基質(zhì)加標試驗，每個添加水平各平行6次，所得溶液經(jīng)GC-MS／MS分析，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD），回收率介于70%～120%及RSD小于20%的最低添加水平即為該物質(zhì)的定量限。由表2可見，本方法的定量限范圍為0.001～0.050 mg／kg。除樂果、抑菌靈、順-氯丹、氧豐索磷砜、β-硫丹和倍硫磷氧亞砜外，其余農(nóng)藥的定量限均不超過0.01 mg／kg，符合歐盟農(nóng)藥殘留限量的要求。

2.4.2 回收率及重復(fù)性

本文采用標準加入法，向空白樣品中加入混合標準溶液和內(nèi)標溶液，制備加標水平分別為0.05、0.10和0.20 mg／kg的樣品各6份，按上述優(yōu)化后的方法提取、凈化樣品，并進行GC-MS／MS分析，基質(zhì)匹配內(nèi)標法定量，計算平均回收率及精密度（RSD）。所有農(nóng)藥的回收率均在66.7%～128.0%之間，RSD在2.1%～18.3%之間。

表2 99種農(nóng)藥的線性范圍、檢出限、回收率及精密度（n＝6）Table 2 Linear ranges，limits of quantification （LOQ），spiked recoveries and precisions（RSDs）of the 99 pesticides（n＝6）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

2.5 樣品測定

按照所建立的方法，對來自亳州中藥材市場的13批白芍樣品進行了分析，其中4批樣品檢測到毒死蜱和p，p′-DDE這兩種農(nóng)藥殘留，檢出率為31%。毒死蜱的最高殘留量為 0.023 3 mg／kg，p，p′-DDE的最高殘留量為0.015 9 mg／kg，均遠遠低于歐盟最大殘留限量0.2 mg／kg和1 mg／kg。

3 結(jié)論

本文采用氨基固相萃取凈化技術(shù)結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法建立了白芍藥材中99種農(nóng)藥同時檢測的分析方法。采用基質(zhì)匹配標準曲線內(nèi)標法定量對基質(zhì)效應(yīng)進行了一定的補償。該方法準確可靠、靈敏度高，為白芍中多種農(nóng)藥殘留的同時測定提供了一種有力的分析手段。

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