劉紫英+冷桂華+周秀玲

摘要：為了解我國(guó)特有珍稀植物華木蓮葉片的內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)特征，以華木蓮葉片為材料，采用組織分離法分離華木蓮的內(nèi)生真菌。結(jié)果表明，PDA改良培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基內(nèi)加20 g/L華木蓮葉汁液、30 mg/L 鏈霉素）的分離效果最好。從華木蓮的葉中共分離得到87株內(nèi)生真菌，經(jīng)顯微形態(tài)鑒定，鑒定菌株74株，為4目5科10屬，分別為青霉屬、木霉屬、曲霉屬、小孢霉屬、交鏈孢屬、枝孢屬、長(zhǎng)蠕孢屬、鐮孢霉屬、擬莖點(diǎn)霉屬、絲核菌屬，結(jié)果顯示葉中內(nèi)生真菌菌群多樣性較豐富，優(yōu)勢(shì)屬為無(wú)性絲孢類(lèi)菌群中青霉屬、木霉屬、交鏈孢屬和無(wú)性腔孢類(lèi)擬莖點(diǎn)霉屬；分離率分別為17.2%、12.6%、10.4%和11.5%，對(duì)開(kāi)發(fā)和利用植物內(nèi)生真菌及豐富真菌的物種具有重要意義。

關(guān)鍵詞：華木蓮；內(nèi)生真菌；分離；鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)： S567.23+9.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0316-03

華木蓮（Sinomanglietia glauca Z.X.Yu et Q.Y.Zheng），別稱(chēng)落葉木蓮， 為木蘭科單種屬植物，是我國(guó)江西省宜春市特有的珍稀瀕危新樹(shù)種，僅狹域分布于宜春市境內(nèi)明月山山地，落葉喬木，1995年被列入國(guó)務(wù)院公布的“國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄”中國(guó)家I級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物[1-3]，同時(shí)被英國(guó)皇家植物園收編在冊(cè)，華木蓮保護(hù)工程已被列入國(guó)家重點(diǎn)植物21種極小種群的保護(hù)工程。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)華木蓮的報(bào)道主要集中在華木蓮生物學(xué)特性及繁殖技術(shù)、保護(hù)生物學(xué)、遺傳多樣性及群落種間聯(lián)結(jié)性等方面[4-6]，施建敏等對(duì)華木蓮葉黃酮類(lèi)化合物抗氧化作用、多糖的提取及其抗氧化作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，華木蓮葉內(nèi)多糖和黃酮類(lèi)化合物有較好的抗氧化性，華木蓮具有潛在的利用價(jià)值[7-8]。

植物內(nèi)生真菌是近30年國(guó)內(nèi)外真菌資源多樣性和分類(lèi)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。在許多藥用植物和重要價(jià)值植物體內(nèi)，內(nèi)生真菌的組成和分布得到了比較深入的研究[9-11]，但是植物內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性，特有植物可能具有特殊的內(nèi)生真菌區(qū)系組成?，F(xiàn)有研究表明，內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的化學(xué)成分[12]。因此，開(kāi)發(fā)和利用植物內(nèi)生真菌對(duì)于豐富真菌的種類(lèi)、探討真菌和宿主的相互作用和協(xié)同進(jìn)化等都具有重要意義，在保護(hù)植物種質(zhì)資源、分離新的產(chǎn)物和新的活性成分等方面都具有重要的價(jià)值。到目前為止，對(duì)華木蓮內(nèi)生真菌國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有研究報(bào)道，因此筆者以珍稀植物華木蓮葉為試驗(yàn)材料，分離鑒定其內(nèi)生真菌，為華木蓮葉中內(nèi)生真菌種群多樣性分析提供基礎(chǔ)，同時(shí)保護(hù)珍稀植物為江西省的植物資源開(kāi)發(fā)開(kāi)辟了新途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為華木蓮新鮮健康葉片，取于江西省宜春市明月山風(fēng)景區(qū)周邊林木種植場(chǎng)。葉片摘取后，用自來(lái)水沖洗干凈備用。

1.2 培養(yǎng)基

采用改良PDA培養(yǎng)基：200 g 馬鈴薯（煮汁）+20 g 葡萄糖+20 g華木蓮葉（煮汁）+20 g瓊脂，加水定容至 1 000 mL。臨用前加入30 mg/L 氯霉素。

1.3 內(nèi)生真菌分離

選用健康植株的葉片，用自來(lái)水沖洗干凈，切段；超凈工作臺(tái)上，無(wú)菌水清洗2～3次；75%乙醇消毒2 min，無(wú)菌水清洗4次；0.1% HgCl2消毒，消毒時(shí)間設(shè)1、2、2.5、3、3.5、4 min等6個(gè)梯度，以考察其最佳消毒時(shí)間，無(wú)菌水清洗6次，無(wú)菌濾紙吸干水分；用無(wú)菌刀片將葉片切成5 mm×5 mm的小片，分別置于培養(yǎng)基中，26 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，待組織塊周?chē)z生長(zhǎng)旺盛時(shí)再挑取部分菌絲轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。設(shè)無(wú)消毒對(duì)照和空白對(duì)照，將表面消毒后的葉片不作切割處理并放置在相同條件下培養(yǎng)，以確定是否徹底消毒。根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間、菌落的生長(zhǎng)速度和真菌的生長(zhǎng)種類(lèi)確定最佳消毒時(shí)間進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；并對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)，華木蓮的葉分離所得內(nèi)生真菌分別標(biāo)記為SL1、SL2、…、SL87。

1.4 內(nèi)生真菌的鑒定

采用點(diǎn)植法、膠帶粘貼法、真菌學(xué)插片培養(yǎng)法及真菌玻片培養(yǎng)法制成玻片，置于高級(jí)數(shù)碼生物顯微鏡SK-DM500光學(xué)攝像儀下攝像，觀(guān)察菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)，鑒定真菌種類(lèi)[13-14]。對(duì)在人工培養(yǎng)條件下較少產(chǎn)孢的菌株采用菌落造傷、近紫外燈照射、冰箱短暫冷藏等方法誘導(dǎo)產(chǎn)孢。

2 結(jié)果與分析

2.1 HgCl2消毒時(shí)間的確定

0.1% HgCl2的消毒時(shí)間梯度處理結(jié)果顯示，在0.1% HgCl2消毒1 min的培養(yǎng)基內(nèi)可以觀(guān)察到部分明顯的細(xì)菌菌落，2 min以上的消毒效果較好，明顯優(yōu)于1 min，而4 min對(duì)鮮嫩葉的組織損害較大。2、2.5、3 min為比較合適的消毒時(shí)間，綜合分離菌群所得多樣性和消毒效果，試驗(yàn)選取0.1% HgCl2處理2.5 min作為消毒處理時(shí)間，既能除去表面可能帶有的雜菌，又可避免因消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而傷害組織，還能盡可能分離更多的內(nèi)生真菌群落。

2.2 華木蓮內(nèi)生真菌鑒定

用改良PDA平板培養(yǎng)基分離菌株，從菌落形態(tài)、菌體顯微形態(tài)2方面對(duì)所分離的內(nèi)生真菌進(jìn)行觀(guān)察，對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征、顏色、質(zhì)地、生長(zhǎng)培養(yǎng)基顏色變化以及菌絲體和孢子的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，總共分離到內(nèi)生真菌87株，已鑒定菌株75株，為4目5科10屬，均屬絲孢綱，分別為青霉屬、木霉屬、曲霉屬、小孢霉屬、交鏈孢屬、枝孢屬、長(zhǎng)蠕孢屬、鐮孢霉屬、擬莖點(diǎn)霉屬、絲核菌屬（表1），可見(jiàn)華木蓮葉中內(nèi)生真菌菌群多樣性豐富。

2.2 華木蓮內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)分析

表2顯示，華木蓮內(nèi)生真菌均屬絲孢無(wú)性型真菌和腔孢無(wú)性型真菌。在目分類(lèi)水平上，以絲孢目（Hyphomycetales）為優(yōu)勢(shì)菌群，占65.5%。在科的分類(lèi)水平上，叢梗孢科（Moniliaceae）、暗梗孢科（Dematiaceae）和球殼孢科（Sphaeropsidaceae）為優(yōu)勢(shì)菌群，分別占總菌株數(shù)量的44.8%、15.0%、11.5%。在屬的水平上分類(lèi)，絲孢無(wú)性型真菌中青霉屬、交鏈孢屬、木霉屬和腔孢類(lèi)無(wú)性型真菌的擬莖點(diǎn)霉屬分別占所分離菌株數(shù)的172%、10.4%、16.1%和11.5%，為華木蓮內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)種群。因?qū)嶒?yàn)室培養(yǎng)條件下不產(chǎn)孢，有8株菌株無(wú)法鑒定到歸屬的無(wú)孢菌群。這與傳統(tǒng)的真菌菌種鑒定主要通過(guò)菌落及顯微形態(tài)學(xué)觀(guān)察而作出判斷的局限性有關(guān)，因而在以后工作中將結(jié)合分子生物學(xué)以分離的內(nèi)生真菌總DNA為研究對(duì)象，用ITS序列分析法對(duì)華木蓮的內(nèi)生真菌進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。endprint

3 結(jié)論與討論

內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)分布不均衡，隨著外界環(huán)境的改變，在植物中內(nèi)生真菌分布的種類(lèi)、數(shù)量及生長(zhǎng)狀況有所不同[15]。所以，在分離時(shí)要盡量模擬內(nèi)生菌在其宿主體內(nèi)自然狀態(tài)下的生活環(huán)境，以便能夠最大量地分離出內(nèi)生菌。本研究對(duì)PDA培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，改良PDA培養(yǎng)基中添加了宿主植物華木蓮葉汁液，補(bǔ)充了華木蓮內(nèi)生真菌可能需要的特殊營(yíng)養(yǎng)，通過(guò)培養(yǎng)基篩選的前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在這種改良PDA培養(yǎng)基上華木蓮內(nèi)生真菌菌群較豐富，但不能保證所有生活在組織內(nèi)的真菌全部分離出來(lái)，可能有的內(nèi)生真菌不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，或者只能在其他選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。因此，盡量選擇多種分離培養(yǎng)基獲得多種群的內(nèi)生真菌是必要的。

華木蓮內(nèi)生真菌菌群較豐富，分屬于青霉屬、木霉屬、曲霉屬、小孢霉屬、交鏈孢屬、枝孢屬、長(zhǎng)蠕孢屬、鐮孢霉屬、擬莖點(diǎn)霉屬、絲核菌屬。其中，絲孢無(wú)性型真菌的青霉屬、交鏈孢屬、木霉屬和腔孢類(lèi)無(wú)性型真菌的擬莖點(diǎn)霉屬分別占所分離菌株數(shù)的17.2%、12.6%、11.5%和14.9%，為華木蓮內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)種群。植物內(nèi)生真菌的生物多樣性受多種因素影響，同一植物在不同的地理區(qū)域或位點(diǎn)具有不同的內(nèi)生菌類(lèi)群。華木蓮僅生長(zhǎng)于江西省宜春市明月山風(fēng)景區(qū)，所以分離華木蓮葉中不存在不同地域種群的差異。

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