李光遠　王鳳華　蔣燕

摘要：采用不同D600 nm值的農(nóng)桿菌菌液浸泡甘藍種子，研究農(nóng)桿菌浸種對甘藍種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)育的影響，并檢測其轉(zhuǎn)化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌浸種對甘藍種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均有抑制作用，且D600 nm值越高，抑制作用越明顯。此外，農(nóng)桿菌浸種對甘藍幼苗的株高、葉面積、根莖比、鮮質(zhì)量均有顯著抑制作用。葉綠素含量隨D600 nm值增大，呈先增加后降低的趨勢，D600 nm為0.8時，葉綠素含量最高，為7.86 mg/g，D600 nm 為1.6時，葉綠素含量最低，為5.64 mg/g。農(nóng)桿菌浸種不影響SOD活性，但POD、CAT活性均隨著D600 nm值的升高而升高。農(nóng)桿菌浸種能獲得一定的PPT抗性苗，其中D600 nm 為0.8時獲得的抗性苗最多，達到10.32%。PCR結(jié)果顯示農(nóng)桿菌浸種能實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化，其中D600 nm 為1.6時轉(zhuǎn)化率最高，達到2.33%。

關(guān)鍵詞：甘藍；農(nóng)桿菌浸種；種子萌發(fā)；幼苗；轉(zhuǎn)化

中圖分類號： S635.04 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0139-03

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是目前較廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因方法，但是常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法依賴于組織培養(yǎng)[1-2]，導(dǎo)致其應(yīng)用受到一定的限制。農(nóng)桿菌浸種法是近年誕生的一種轉(zhuǎn)基因方法，是將萌發(fā)的種子直接浸在農(nóng)桿菌菌液中，利用農(nóng)桿菌的浸染特性和植物細胞自身的物質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)把外源基因?qū)胧荏w細胞并整合到基因組中穩(wěn)定表達，從而實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化[3]，如Feldmann等首次利用農(nóng)桿菌浸種法將npt[QX（Y15]Ⅱ[QX）]基因?qū)肓藬M南芥[4]，該方法后來相繼在水稻、小麥、黃瓜、番茄、中華結(jié)縷草等植物遺傳轉(zhuǎn)化中取得了成功[5-8]。甘藍的遺傳轉(zhuǎn)化研究起步早，目前已相繼導(dǎo)入抗蟲基因Bt、蛋白酶抑制劑基因、育性基因、抗病基因、生長素基因等[9]?？v觀甘藍的遺傳轉(zhuǎn)化，最常采用的方法還是依賴于組織培養(yǎng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，筆者所在實驗室采用該傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法獲得了部分激活標(biāo)簽突變體[10]，但是轉(zhuǎn)化效率低下，且需要在無菌條件下進行離體操作。因此，本研究將采用農(nóng)桿菌浸種法，將含激活標(biāo)簽pSKI015的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化甘藍，調(diào)查浸種對甘藍種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，并探討其轉(zhuǎn)化效果，以期獲得一種甘藍激活標(biāo)簽突變體材料的簡便轉(zhuǎn)基因方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試甘藍為夏光種子，供試農(nóng)桿菌為GV3101（含質(zhì)粒pSKI015）。

1.2 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

用LB培養(yǎng)基接種農(nóng)桿菌，28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，分光光度計測定600 nm下的D值。

1.3 農(nóng)桿菌浸種

取成熟飽滿發(fā)芽率85%以上的種子，用0.4% KMnO4浸種6 min，無菌水沖洗3～4次，25 ℃催芽。待種子80%露白時，再用無菌水沖洗干凈，加入農(nóng)桿菌液，農(nóng)桿菌菌液D600 nm分別為0（未加入農(nóng)桿菌的LB溶液，對照）、0.4、0.8、1.2、1.6。浸種2 h，倒掉菌液，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿（濾紙使用1 mg/L的PPT浸濕，適時補加），置于 20 ℃、14 h/d光照的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察記載發(fā)芽情況。

1.4 幼苗移栽

種子發(fā)芽后統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)。用自來水將幼苗沖洗干凈，移栽于穴盤培養(yǎng)。

1.6 生理指標(biāo)測定

取移栽30 d的苗，測定各生理指標(biāo)[11]。采用丙酮提取法測定葉綠素含量，氮藍四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性。

1.7 PPT抗性苗篩選

浸種后的種子播種在含1 mg/L PPT的培養(yǎng)皿中發(fā)芽，移栽穴盤后后噴施10 mg/L Basta溶液。

1.8 PCR檢測

CTAB提取PPT抗性苗葉片基因組DNA，以BarF （5′-TCGACTCTAGCGAATTC）和BarR（5′-ATAGGCGTCTCGCATATCTC）為引物擴增長度為700 bp的bar基因，未轉(zhuǎn)化的甘藍為陰性對照，pSKI015為陽性對照，擴增方法和程序參照王愛榮等的方法[12]。PCR 反應(yīng)總體積 25μL。擴增程序：5 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 35 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。取擴增產(chǎn)物10 μL于1% 瓊脂糖凝膠上電泳。

1.9 數(shù)據(jù)處理

用SPSS系統(tǒng)軟件進行數(shù)據(jù)處理，Microsoft Excel軟件作圖，P<0.05作為顯著性檢測標(biāo)準。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌浸種對甘藍種子萌發(fā)的影響

由表1可知，隨著農(nóng)桿菌D600 nm的升高，甘藍種子發(fā)芽率基本呈現(xiàn)下降趨勢，其中D600 nm 為0.4時，與對照差異不顯著，但是D600 nm為0.8、1.2、1.6時的發(fā)芽率顯著低于對照，D600 nm為1.6時，發(fā)芽率最低，D600 nm為0.8 和D600 nm為1.2處理之間差異不顯著。發(fā)芽指數(shù)的變化與發(fā)芽率的變化類似，隨著D600 nm的升高而降低，除D600 nm為 0.4與對照差異不顯著外，其他各處理的種子發(fā)芽指數(shù)均顯著低于對照。種子活力指數(shù)的變化也是隨著D600 nm的升高而降低。除D600 nm為 0.4與對照差異不顯著外，其他各處理的種子活力指數(shù)均顯著低于對照。不同的D600 nm之間也存在差異，其中D600 nm 為1.6處理下，種子的活力指數(shù)最低，僅為53.6%。由此可知，農(nóng)桿菌的D600 nm過高，對甘藍種子的萌發(fā)有抑制作用。

2.2 農(nóng)桿菌浸種對甘藍幼苗生長的影響

由表2可知，對照組的根莖比最大，且隨著D600 nm值的增加，根莖比逐漸減小，所有處理的根莖比均顯著低于對照，D600 nm為 0.4、0.8、1.2 3者之間差異不大，D600 nm為1.6處理時的根莖比最低，僅為0.70，比對照降低了約18%。因此，農(nóng)桿菌浸種對甘藍幼苗的根莖比有抑制作用。甘藍幼苗的葉面積也隨著D600 nm值的增加而降低，其中D600 nm為 0.4與對照差異并不顯著，對照組的葉面積最大，D600 nm為 1.6的葉面積最小。由此可知，農(nóng)桿菌浸種對甘藍幼苗葉面積有抑制作用，在D600 nm高于0.8時開始表現(xiàn)較明顯的抑制效應(yīng)。株高的變化與根莖比和葉面積的變化有所不同，僅在D600 nm為1.2、1.6下表現(xiàn)抑制效應(yīng)。在D600 nm達到1.6時，株高僅為對照的72%。所有單株鮮質(zhì)量中，對照組最大，與各處理之間差異顯著。D600 nm值為1.6時單株鮮質(zhì)量最低，僅為對照的56%，D600 nm 為0.4、0.8、1.2 3組之間差異不顯著。由此可見，農(nóng)桿菌浸種對甘藍幼苗生長存在一定的抑制作用。

2.3 農(nóng)桿菌浸種對甘藍生理指標(biāo)的影響

由表3可以看出，在農(nóng)桿菌D600 nm低于0.8時，隨D600 nm的增大，葉綠素含量增加，D600 nm為0.8時，葉綠素含量達到最大值，之后隨著D600 nm的進一步增大，葉綠素含量開始下降，且明顯低于對照，在D600 nm 達到1.6時，葉綠素含量最低。由此可知，高濃度農(nóng)桿菌菌液浸種會降低甘藍的葉綠素含量。

表3還顯示，各處理之間SOD活性差異并不顯著，說明農(nóng)桿菌浸種并不影響SOD活性。POD活性均隨著D600 nm值的增大而升高，對照組的POD活性最低，當(dāng)D600 nm值大于0.8時POD活性顯著提高，說明農(nóng)桿菌已經(jīng)對甘藍造成脅迫，POD活性提高，其清除自由基的能力也提高，從而避免植株受到傷害。CAT活性的變化也是隨著農(nóng)桿菌菌液濃度升高而增加，當(dāng)D600 nm大于0.4時，其與對照的差異已經(jīng)達到顯著水平。由此可見，農(nóng)桿菌菌液浸種對甘藍是一種脅迫，為了提高其適應(yīng)逆境的能力，POD活性升高以清除產(chǎn)生的自由基。

2.4 農(nóng)桿菌浸種對PPT抗性苗率及轉(zhuǎn)化率的影響

由表4可以看出，采用農(nóng)桿菌浸種甘藍能獲得一定的PPT抗性苗，其中D600 nm 為0.8時獲得的抗性苗最多，PPT抗性苗率可以達到10.32%，D600 nm 為1.6時獲得的抗性苗最少，僅為8.34%。

提取PPT抗性植株葉片的基因組 DNA，進行PCR 擴增，部分植株擴增到了長約為 700 bp的片段（圖1-B、C、D、G、H），與從質(zhì)粒Pski015擴增出的片段基本相同（圖1-J），說明基因已經(jīng)整合到了轉(zhuǎn)化植株中，但也有例外，如圖1-E擴增出的片段明顯比對照大，具體原因有待進一步研究。

經(jīng)PCR檢測，統(tǒng)計轉(zhuǎn)化率結(jié)果如表4。由表4可以看出，轉(zhuǎn)化率的大小依次為D600 nm 0.4

3 討論

植物在逆境條件下通常會表現(xiàn)出衰老癥狀，如葉綠素含量降低，蛋白質(zhì)、核酸等大分子水解加速，原生質(zhì)膜以及內(nèi)膜系統(tǒng)發(fā)生過氧化，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量增加，POD酶促防御系統(tǒng)活性下降等[13]。本研究結(jié)果表明甘藍幼苗葉片中的葉綠素含量隨菌液D600 nm值的增加成先升高后降低的趨勢，在 D600 nm為0.8時，葉綠素含量達到最大值，之后開始下降，這與徐開杰等的研究結(jié)果[14]有所不同，他們發(fā)現(xiàn)隨著農(nóng)桿菌菌液濃度升高，小麥幼苗葉片中葉綠素含量呈下降趨勢。徐開杰等的結(jié)果顯示小麥POD活性隨農(nóng)桿菌菌液濃度升高呈先升后降的趨勢[14]，而本研究證實甘藍的POD隨著D600 nm的增加一直成上升趨勢。本研究結(jié)果還表明隨著農(nóng)桿菌菌液濃度升高，甘藍種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、幼苗株高、鮮質(zhì)量含量呈下降趨勢，這與徐開杰等的結(jié)果[14]一致。因此，農(nóng)桿菌浸種對甘藍是一種脅迫作用，特別是高濃度的農(nóng)桿菌會影響萌發(fā)和幼苗的生長代謝。

轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效果的重要指標(biāo)，本研究結(jié)果表明在低D600 nm值時（D600 nm<0.8），轉(zhuǎn)化率為零，這與陳明利等的結(jié)果[15]類似，他們認為農(nóng)桿菌濃度D600 nm值小于0.5時，即使采用長時間侵染，轉(zhuǎn)化效率也不高。但是農(nóng)桿菌菌液濃度也不宜過高，如本研究中在D600 nm為1.6時，獲得的轉(zhuǎn)化率雖然較高，但是在此處理下甘藍幼苗生長嚴重受抑、甚至死亡。陳明利等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液D600 nm超過1.5時，對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育產(chǎn)生了較為嚴重的傷害作用，小麥種子發(fā)芽率顯著降低，幼苗出現(xiàn)生長減慢、停止甚至出現(xiàn)白化、最終死亡的現(xiàn)象[15]。他們認為從獲得轉(zhuǎn)基因植株的規(guī)模方面考慮，農(nóng)桿菌菌液D600 nm不超過1.5，這與本研究結(jié)果是一致的。

目前，依賴于組織培養(yǎng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化仍然是甘藍轉(zhuǎn)基因研究的主要手段。但是這種方法操作繁瑣，需要高頻率的再生系統(tǒng)，特別是組織培養(yǎng)要求無菌，而農(nóng)桿菌本身又是一種細菌，這增加了無菌操作的難度。因此，探索一種簡單、快捷、高效的遺傳轉(zhuǎn)化方法勢在必行。種子浸泡法是最近誕生的一種用于植物轉(zhuǎn)化的方法，已經(jīng)取得了一定的成功。本研究證實采用農(nóng)桿菌浸種甘藍也可以實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移，雖然轉(zhuǎn)化率僅為2.33%，但今后深入研究將有助于獲得轉(zhuǎn)化率更高的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體系。

參考文獻：

[1]劉 凡，王國英，曹鳴慶. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物原位轉(zhuǎn)基因方法研究進展[J]. 分子植物育種，2003，1（1）：108-115.

[2]鄭 杰. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（2）：6-7，10.

[3]張慶祝，韓天富. 植物非組培遺傳轉(zhuǎn)化方法研究的進展[J]. 分子植物育種，2004，2（1）：85-91.

[4]Feldmann K A，Marks M D. Agrobaterium mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana：a non-tissue culture approach[J]. Molecular & General Genetics，1987，208：1-9.

[5]許 耀，王 艇，李寶健. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化植物萌動種胚的研究[J]. 實驗生物學(xué)報，1991，24（2）：109-117.

[6]奚亞軍，張啟發(fā)，林擁軍，等. 利用農(nóng)桿菌浸種法將葉片衰老抑制基因PSAG12-IPT導(dǎo)入普通小麥的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（8）：1235-1238.

[7]雷江麗，王 丹，吳燕民，等. 農(nóng)桿菌浸種法介導(dǎo)中華結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2009，17（5）：865-871.

[8]林擁軍. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001.

[9]秦耀國，雷建軍，曹必好，等. 甘藍類蔬菜遺傳轉(zhuǎn)化研究進展[J]. 中國蔬菜，2004（4）：61-63.

[10]王鳳華，陳雙臣，李光遠，等. 激活標(biāo)簽轉(zhuǎn)化結(jié)球甘藍的研究[J]. 西北植物學(xué)報，2009，29（5）：905-909.

[11]張立軍，樊金娟. 植物生理學(xué)實驗教程[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007.

[12]王愛榮，吳智芳，張麗麗，等. 影響擬南芥轉(zhuǎn)化效率和激活標(biāo)簽丟失的因素分析[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2006，35（3）：298-302.

[13]徐開杰，孟 敏，史麗麗，等. 農(nóng)桿菌對大麥種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)育的影響[J]. 西北植物學(xué)報，2009，29（7）：1408-1414.

[14]徐開杰，史麗麗，劉曙東，等. 農(nóng)桿菌浸種處理對小麥種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)育的影響[J]. 西北植物學(xué)報，2011，31（5）：985-994.

[15]陳明利，劉香利，唐廣立，等. 農(nóng)桿菌侵染小麥的優(yōu)化方案[J]. 分子植物育種，2007，5（4）：577-582.