李媛媛 余敏君 游曉星 李冉輝 陳列松 朱翠明 文道林 曾焱華

支原體巨噬細胞活化脂肽-2誘導人單核細胞分泌MMP-9

李媛媛 余敏君 游曉星 李冉輝 陳列松 朱翠明 文道林 曾焱華

目的 觀察支原體巨噬細胞活化脂肽-2（MALP-2）對人單核細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的影響。方法 體外培養(yǎng)人單核細胞系THP-1，分別采用0、0.1、1.0和5.0 μg/mL MALP-2刺激THP-1細胞12～18 h，采用實施定量PCR檢測MMP-9 mRNA的表達，熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）檢測MMP-9的酶活性變化，ELISA檢測培養(yǎng)上清中MMP-9的含量。結(jié)果 THP-1細胞未刺激時，MMP-9的mRNA表達量、酶活性以及分泌水平極低。當給予0.1～5.0μg/mL MALP-2作用18 h后，MMP-9的分泌水平顯著增高，細胞培養(yǎng)上清液中MMP-9的酶活性也明顯增強。此外，5.0μg/mL MALP-2刺激THP-1細胞6 h后即可誘導MMP-9 mRNA表達，16 h后達到峰值。結(jié)論 MALP-2可誘導人單核細胞表達MMP-9，這可能是支原體感染早期重要的致病因素。

支原體巨噬細胞活化脂肽-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；單核細胞

支原體是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物。目前已明確的對人類致病的支原體主要包括肺炎支原體（Mycoplasma. pneumoniae）、生殖支原體（M. genitalium）、人型支原體（M. hominis）等[1-3]。研究表明，支原體感染后所致的炎癥反應(yīng)主要與其細胞膜上的膜脂蛋白有關(guān)。支原體膜脂蛋白N末端的二酰甘油半胱氨酸結(jié)構(gòu)是活化單核、巨噬細胞的基礎(chǔ)[4]。巨噬細胞活化脂肽2（macrophage-activating lipopeptide-2，MALP-2）是根據(jù)支原體膜脂蛋白二酰甘油半胱氨酸結(jié)構(gòu)人工合成的一種脂肽，它幾乎所有支原體膜脂蛋白的免疫刺激活性，因此被廣泛應(yīng)用于支原體感染以及各種免疫機制相關(guān)研究[5-6]。支原體感染后可活化單核、巨噬細胞，并誘導其分泌一系列炎癥相關(guān)介質(zhì)，如細胞因子、趨化因子、活性氧類、前列腺素、一氧化氮等分子?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs)是一類能降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的酶類。多種因素可誘導MMPs的表達，如細胞因子、生長因子等。微生物感染后，可誘導單核細胞趨化至感染部位并分泌多種MMPs，從而參與炎癥反應(yīng)、組織重構(gòu)、血管發(fā)生和傷口愈合。在所有的MMPs中，以MMP-9最重要。研究顯示，MMP-9的分泌與氣道高反應(yīng)性有關(guān)，在哮喘和阻塞性肺疾病中，MMP-9的水平顯著增高。這表明MMP-9可能與呼吸道炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，但迄今為止缺乏支原體感染與MMP-9的相關(guān)報道。本研究通過體外實驗觀察MALP-2對人THP-1單核細胞分泌MMP-9的影響，探討支原體潛在的致病機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol試劑為Invitrogen產(chǎn)品；FastStart Essential DNA Green Master購自Roche。人MMP-9 ELISA檢測試劑盒購自深圳欣博盛生物有限公司。MMP-9酶活性檢測試劑盒購自AnaSpec（SensoLyte? 490 MMP-9 Assay Kit）。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理 人單核細胞系THP-1用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。待細胞生長密度達到視野的80%時，將其接種至24孔板中（細胞數(shù)約5×105），加入終濃度為0、0.1、1.0和5.0 μg/mL MALP-2刺激18 h，或用5.0 μg/mL MALP-2刺激0～36 h，隨后獲取上清用于下一步研究。

1.3 MMP-9 mRNA水平分析 采用實時定量PCR（Real-time PCR）檢測MMP-9 mRNA的表達。細胞經(jīng)MALP-2孵育結(jié)束后，用Trizol試劑提取細胞總RNA并測量其濃度。取2 μg RNA用于Real-time PCR分析。設(shè)計MMP-9和GAPDH引物，并由上海生工合成。MMP-9引物序列分別為：5’-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3’(正向)和5’-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3’（反向）；GAPDH：5’-AGGGCTGCTTTTAAC TCTGGT-3’(正向)和5’-CCCCACTTGATTTTGGAGGGA-3’。反應(yīng)條件是： 94℃3 min，然后94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 30 s，總共40個循環(huán)（LightCycle @96）。所得數(shù)據(jù)與內(nèi)參GAPDH之比作為相對值。

1.4 MMP-9酶活性檢測 細胞經(jīng)MALP-2刺激完畢后，獲取培養(yǎng)上清，采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）間接法測定MMP-9的酶活性。其原理為MMP-9可降解底物FRET peptide，從而使DabcylPlusTM無法淬滅熒光分子EDANS，后者可通過激化熒光而檢測到，其熒光強度與MMP-9的活性成正比。具體操作根據(jù)AnaSpec公司提供的試劑盒操作步驟進行。在熒光酶標儀（Synergy HT,Bio-Tec）上測定其強度（激發(fā)/發(fā)射波長分別為340和490 nm），并計算各組與對照組的比值（相對活性）。

1.5 MMP-9分泌檢測 細胞處理結(jié)束后，通過反復凍融以裂解細胞。經(jīng)1000 r/min離心5 min后，棄沉淀，采用雙抗體夾心ELISA法檢測上清中MMP-9的含量。操作方法按照深圳欣博盛生物有限公司提供的試劑盒操作步驟進行。結(jié)果以相對含量表示（處理組吸光值/對照組吸光值×100%）。

1.6 統(tǒng)計學方法 所有實驗數(shù)據(jù)重復3次，應(yīng)用

SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度MALP-2誘導THP-1細胞分泌MMP-9 THP-1細胞基礎(chǔ)狀態(tài)下MMP-9分泌水平極低。當給予0.1、1.0、5.0 μg/mL MALP-2作用18 h后，可顯著誘導THP-1細胞分泌MMP-9，且隨著MALP-2濃度的增加，MMP-9的分泌水平進一步增多。見圖1。

圖1 不同濃度MALP-2對THP-1細胞分泌MMP-9的影響注：與對照組（0 μg/mL）相比，aP＜0.05

2.2 MALP-2誘導THP-1細胞表達MMP-9 mRNA MALP-2處理THP-1細胞16 h后，也可上調(diào)細胞內(nèi)mRNA的表達。當MALP-2濃度為5.0 μg/mL時，MMP-9 mRNA表達水平增加了4.3倍。見圖2。

圖2 不同濃度MALP-2對MMP-9 mRNA表達的影響注：與對照組（0 μg/mL）相比，aP＜0.05

2.3 MALP-2作用不同時間對THP-1表達MMP-9的影響 MALP-2作用THP-1細胞6 h后即可上調(diào)MMP-9 mRNA表達，隨著時間的延長，mRNA表達水平逐漸增高，16 h后達到峰值，并持續(xù)高表達至36 h。見圖3。

2.4 不同濃度MALP-2對MMP-9活性的影響 THP-1細胞未刺激時，培養(yǎng)上清液中MMP-9酶活性很低。經(jīng)不同濃度MALP-2作用后，MMP-9酶活性隨著MALP-2濃度的增加而逐漸增強。見圖4。

3 討論

MMPs是一類Zn2+依賴性的肽鏈內(nèi)切酶，可降解組織中的ECM。MMPs根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為4個不同的功能區(qū)，分別為疏水信號肽區(qū)、催化區(qū)、前肽區(qū)、羧基末端區(qū)和鉸鏈區(qū)。其中前肽區(qū)和酶催化活性區(qū)結(jié)構(gòu)非常保守，但各種MMPs又具有不同的功能，如，不同的MMPs對底物具有專一性，但也非絕對[7]。同一種MMPs可降解多種ECM，而某些特定的ECM又可被多種MMPs降解。盡管如此，不同MMPs對同一ECM的降解效率也有所不同。MMPs家族根據(jù)底物特異性和結(jié)構(gòu)相似性可大致分為膠原酶、間質(zhì)溶解素、明膠酶、基質(zhì)溶解因子和膜型金屬蛋白酶[8]。其中明膠酶主要包括MMP-2和MMP-9，兩者主要降解IV/V型膠原。研究表明，MMP-2和MMP-9廣泛表達于白細胞、氣道上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞以及腫瘤細胞等。MMP-2通常為組成性表達，而MMP-9為誘導型。在各種感染性疾病、炎癥反應(yīng)、血管病變和惡性腫瘤的發(fā)生過程中，MMP-9表達往往上調(diào)表達[9-10]。

圖3 MALP-2作用不同時間對MMP-9 mRNA表達的影響注：與對照組（0 h）相比，aP＜0.05

圖4 不同濃度MALP-2對MMP-9酶活性的影響注：與對照組（0 μg/mL）相比，aP＜0.05

研究表明，MMPs參與了支原體感染后的發(fā)病過程。Baluk等[11]研究發(fā)現(xiàn)，鼠支原體感染大鼠肺組織中MMP-2和MMP-9含量顯著增高，但該過程與血管重構(gòu)無關(guān)。隨后Peltier[12]的研究也表明，鼠肺炎支原體感染妊娠期大鼠后，羊水中前MMP-9的分泌也顯著增高。此外，肺炎支原體所致的社區(qū)獲得性肺炎患者血清中MMP-9的含量也明顯高于正常人群[13]。目前國內(nèi)外的研究多集中在支原體感染動物模型或肺炎患者體內(nèi)MMPs水平的檢測及，而對于體外研究較少。本實驗通過體外培養(yǎng)人單核細胞，采用支原體的病原相關(guān)分子模式MALP-2對MMP-9的分泌情況進行觀察，結(jié)果顯示，THP-1細胞未經(jīng)MALP-2處理時，MMP-9 mRNA的表達水平、培養(yǎng)上清中MMP-9的分泌情況及酶活性較低。而當單核細胞與MALP-2作用后，上清中MMP-9的濃度顯著增高，與臨床肺炎支原體感染患者外周血中MMP-9變化趨勢抑制。Real-time PCR也證實MALP-2刺激細胞6 h后即可上調(diào)其mRNA表達水平，并持續(xù)至36 h。MMP-2的表達同時也伴隨有酶活性的增高。本研究采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理對MMP-9的酶活性進行觀察，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，隨著MALP-2濃度的增加，酶活性逐漸增強，與ELISA檢測結(jié)果一致。

總之，支原體MALP-2能誘導并促進人單核細胞表達MMP-9，從而參與對ECM的降解。隨著ECM的廣泛降解，在感染早期會使更多的白細胞滲出至感染部位，或者促進支原體進一步擴散，從而加劇局部組織的破壞，促進疾病的發(fā)生發(fā)展。

[1] Citti C,Blanchard A.Mycoplasmas and their host:emerging and reemerging minimal pathogens[J].Trends Microbiol,2013,21(4):196-203.

[2] Catrein I,Herrmann R.The proteome of Mycoplasma pneumoniae,a supposedly "simple" cell[J].Proteomics,2011,11(18):3614-3632.

[3] McGowin CL,Radtke AL,Abraham K,et al.Mycoplasma genitalium infection activates cellular host defense and inflammation pathways in a 3-dimensional human endocervical epithelial cell model[J].J Infect Dis,2013,207(12):1857-1868.

[4] Quentmeier H,Schmitt E,Kirchhoff H,et al.Mycoplasma fermentansderived high-molecular-weight material induces interleukin-6 release in cultures of murine macrophages and human monocytes[J].Infect Immun,1990,58(5):1273-1280.

[5] Gao F,Brant KA,Ward RM,et al.Multiple protein kinase pathways mediate amplified IL-6 release by human lung fibroblasts coexposed to nickel and TLR-2 agonist,MALP-2[J].Toxicol Appl Pharmacol,2010,247(2):146-157.

[6] Sawahata R,Shime H,Yamazaki S,et al.Failure of mycoplasma lipoprotein MALP-2 to induce NK cell activation through dendritic cell TLR 2[J]. Microbes Infect,2011,13(4):350-358.

[7] Vandenbroucke RE,Libert C.Is there new hope for therapeutic matrix metalloproteinase inhibition?[J].Nat Rev Drug Discov,2014,13(12):904-927.

[8] Thomas NV,Manivasagan P,Kim SK.Potential matrix metalloproteinase inhibitors from edible marine algae:a review[J].Environ Toxicol Pharmacol,2014,37(3):1090-1100.

[9] 楊麗君,陳鐘.OPN和MMP-9在結(jié)直腸癌中的表達及其與肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性[J].當代醫(yī)學,2012,18(12):7-9.

[10] 王海波,俞為榮.MMP-2/MMP-9在炎癥中的研究進展[J].醫(yī)學綜述,2014,20(17):3120-3122.

[11] Baluk P,Raymond WW,Ator E,et al.Matrix metalloproteinase-2 and-9 expression increases in Mycoplasma-infected airways but is not required for microvascular remodeling[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2004,287(2):L 307-317.

[12] Peltier MR,Barney BM,Brown MB.Effect of experimental genital mycoplasmosis on production of matrix metalloproteinases in membranes and amniotic fluid of Sprague-Dawley rats[J].Am J Reprod Immunol,2007,57(2):116-121.

[13] Puljiz I,Markotic A,Cvetko KL,et al.Mycoplasma pneumoniae in adult community-acquired pneumonia increases matrix metalloproteinase-9 serum level and induces its gene expression in peripheral blood mononuclear cells[J].Med Sci Monit,2012,18(8):CR 500-505.

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.29.002

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