江明殊　王躍華　劉濤等

摘要：以有效組分含量高的多倍體川貝母鱗莖芽為研究對(duì)象，開(kāi)展快速獲得脫毒苗的培養(yǎng)研究。結(jié)果表明，對(duì)多倍體川貝母鱗莖芽誘導(dǎo)不定根選取在35 ℃高溫預(yù)脫毒處理后，選取生長(zhǎng)狀況好的不定根，切取其長(zhǎng)度為0.4 mm的生長(zhǎng)點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行培養(yǎng)，不僅愈傷組織誘導(dǎo)率高（57.89%），而且經(jīng)檢測(cè)其脫毒效果也最好（脫毒率為92.87%）。最佳多倍體脫毒鱗莖芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA，培養(yǎng)40 d后出芽率達(dá)到77.31%；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA，培養(yǎng)30 d后生根率為8917%。

關(guān)鍵詞：川貝母；多倍體；脫毒苗；誘導(dǎo)；愈傷組織

中圖分類(lèi)號(hào)： Q945.39 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0041-02

川貝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）是百合科多年生草本植物，具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳之功效，是稀有的治療咳嗽等的良藥[1]，由于川貝母價(jià)格昂貴，加上近年來(lái)無(wú)計(jì)劃盲目地采挖，使其自然資源日趨枯竭[2-3]，這種狀況預(yù)計(jì)在近幾十年內(nèi)也難以緩解。川貝母植物的繁殖常采用以種子進(jìn)行的有性生殖和以鱗莖進(jìn)行的無(wú)性繁殖2種方式。無(wú)論是哪種方式，對(duì)于多年生的川貝母植物都會(huì)因各種環(huán)境因素而使其染上病毒，而且經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期繁殖，這些病毒會(huì)在細(xì)胞體內(nèi)不斷累積，從而嚴(yán)重抑制其生長(zhǎng)，此外其性狀、產(chǎn)量等也會(huì)受到影響，最終造成川貝母藥材的品質(zhì)和產(chǎn)量大大地下降。

無(wú)論是適應(yīng)性還是生活力，多倍體植物與二倍體植物相比都有許多優(yōu)勢(shì)。例如，多倍體植物因基因數(shù)目增多、基因活性及酶的差異性增強(qiáng)，其生態(tài)適應(yīng)性和對(duì)逆境的抗耐性較高[4]；隨著藥用植物基因倍性的增加，通常還能導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物含量的變化，從而得到有效含量較高的產(chǎn)物。已有報(bào)道表明，藥用植物多倍體可大幅度提高藥材的產(chǎn)量[5-7]，而且筆者所在課題組也在前期研究中發(fā)現(xiàn)多倍體川貝母的有效含量比自然野生二倍體川貝母高得多。將川貝母植物的脫毒苗培育技術(shù)和多倍體誘導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，能培育出品質(zhì)優(yōu)良、生長(zhǎng)速度快、有效組分含量高和抗逆性強(qiáng)的多倍體川貝母脫毒苗，有利于川貝母大規(guī)模生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)材料來(lái)自成都大學(xué)組培實(shí)驗(yàn)室培育的多倍體川貝母鱗莖。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多倍體不定根的獲得 將多倍體川貝母組培鱗莖先接種于1/2MS+0.2 mg/L IBA的培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為 21 ℃、光照時(shí)間6 h/d且光照度為1 000 lx的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，獲得形狀粗大的不定根。

1.2.2 多倍體脫毒愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng) 將多倍體不定根從根基部切下后接入MS+0.3 mg/L 6-BA+150 mL/L甘油的培養(yǎng)基中，設(shè)置不同溫度條件（35、36、37、38、39、40 ℃，分別記為A1、A2、A3、A4、A5、A6處理）且在無(wú)光照條件下進(jìn)行20 d預(yù)培養(yǎng)處理，觀察不定根的生長(zhǎng)狀況，20 d后統(tǒng)計(jì)經(jīng)上述不同方法處理的不定根成活率。選取最佳溫度處理的不定根，在超凈工作臺(tái)上切取根尖生長(zhǎng)點(diǎn)處0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mm 區(qū)域的細(xì)胞（分別記為B1、B2、B3、B4、B5處理），將其接入pH值為5.8的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度18 ℃、光照時(shí)間6 h/d、光照度800 lx的條件下培養(yǎng) 30 d，獲得多倍體愈傷組織，觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)情況。

1.2.3 病毒檢測(cè) 采用雙抗體夾心ELISA方法[8]（DAS-ELISA）對(duì)培育的川貝母多倍體愈傷組織進(jìn)行病毒檢測(cè)。

1.2.4 鱗莖芽的誘導(dǎo) 選取質(zhì)地較緊密、生長(zhǎng)速度快且顏色為黃白色或淡黃色的多倍體愈傷組織，將其接入添加0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L 6-BA，0、0.2 mg/L IAA不同濃度激素的多倍體鱗莖芽誘導(dǎo)MS培養(yǎng)基（分別記為C0、C1、C2、C3、C4處理）中，同時(shí)以不添加任何激素的MS培養(yǎng)基為對(duì)照，在培養(yǎng)溫度為20 ℃、光照時(shí)間16 h/d、光照度為2 000 lx的條件下培養(yǎng)20 d，獲得川貝母多倍體鱗莖芽。

1.2.5 多倍體鱗莖芽的生根培養(yǎng) 在超凈臺(tái)上切取生長(zhǎng)20 cm的多倍體鱗莖芽作為無(wú)根苗，將其轉(zhuǎn)入添加不同濃度NAA （0、0.2 mg/L）、IBA （0、0.1、0.2、0.3 mg/L）激素的1/2MS 生根培養(yǎng)基（分別記為D1、D2、D3、D4處理）中誘導(dǎo)生根，30 d后觀察記錄鱗莖芽的生根情況。

1.2.6 煉苗和移栽 選取長(zhǎng)出2條以上不定根的川貝母多倍體脫毒苗，打開(kāi)瓶蓋，在室內(nèi)煉苗3～5 d后從培養(yǎng)瓶中取出，洗去不定根上的培養(yǎng)基，移栽至消毒后的松軟土壤中生長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理溫度對(duì)不定根生長(zhǎng)的影響

本研究采用高溫作為多倍體川貝母脫毒的前期處理方法，從表1可以看出，隨著溫度的增加，外植體的成活率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，成活率最高，為6309%；而溫度升到40 ℃時(shí)，成活率最低，只有27.12%。符國(guó)芳曾報(bào)道，對(duì)外植體的熱處理脫毒通常在35～54 ℃較適宜[9]，本研究選取了35～40 ℃作為試驗(yàn)條件，雖然有報(bào)道稱(chēng)溫度越高對(duì)脫毒的效果越好，但從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，高溫對(duì)外植體存活率的影響也是較大的。綜合整體因素考慮認(rèn)為，35 ℃時(shí)為不定根前期脫毒的最佳溫度。

2.2 不同根尖長(zhǎng)度對(duì)脫毒效果的影響

外植體的大小同樣會(huì)影響脫毒的效率[10]，通常情況下采用莖尖脫毒所選取的莖尖大小一般為0.1～0.5 mm，高于這個(gè)范圍值脫毒效果不好，太低又不利于愈傷組織的形成。從表2可以看出，選取不同根尖長(zhǎng)度對(duì)脫毒的影響有著類(lèi)似的結(jié)果，隨著根尖長(zhǎng)度的不斷增加，脫毒率基本逐漸降低，但是愈傷組織誘導(dǎo)率卻與之成反比。例如，0.2 mm根尖長(zhǎng)度的脫毒率最好，達(dá)到了95.16%，但是其愈傷組織誘導(dǎo)率只有2216%；1.0 mm根尖長(zhǎng)度的脫毒率僅有63.13%，而愈傷組織誘導(dǎo)率卻是所取根尖長(zhǎng)度中最高的，達(dá)到了93.64%。綜合整體因素考慮可知，選取根尖長(zhǎng)度為0.4 mm時(shí)為最佳，其脫毒率在5個(gè)處理中較高，為92.87%，并且其愈傷組織也較易形成，誘導(dǎo)率達(dá)到了57.89%。