余 洋 張路生

三峽大學(xué)第一臨床學(xué)院， 宜昌市中心人民醫(yī)院泌尿外科（宜昌 443003）

Raptor調(diào)節(jié)前列腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制研究

余 洋 張路生

三峽大學(xué)第一臨床學(xué)院， 宜昌市中心人民醫(yī)院泌尿外科（宜昌 443003）

目的 探討Raptor調(diào)節(jié)前列腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）作用及機(jī)制研究。方法 構(gòu)建Raptor-shRNA慢病毒載體并篩選具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Raptor-shRNA DU145細(xì)胞株，應(yīng)用transwell觀察沉默Raptor后DU145細(xì)胞株侵襲力的變化，Western Blot觀察沉默Raptor后DU145細(xì)胞E-cadherin， β-catenin， N-cadherin和vimentin表達(dá)，以及RhoA活性表達(dá)。結(jié)果 成功構(gòu)建Raptor-shRNA DU145細(xì)胞株；transwell檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Raptor-shRNA后DU145細(xì)胞侵襲力下降（P＜0.01）；Western Blot檢測顯示該細(xì)胞株E-cadherin和β-catenin表達(dá)下降，N-cadherin 和 vimentin表達(dá)升高，RhoA活性表達(dá)下降。結(jié)論 Raptor與前列腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生有關(guān)，其作用可能是通過RhoA信號途徑。

前列腺腫瘤； 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化； Raptor

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在歐美發(fā)病率居男性惡性腫瘤第一位，死亡率第二位［1］。在我們國家，隨著人們生活水平的提高、人口老年化和生活方式的改變，前列腺癌的發(fā)病率也越來越高。前列腺癌的早期治療效果較好，但在我國由于沒有開展前列腺癌篩查，前列腺癌的發(fā)現(xiàn)都已在晚期了，晚期前列腺癌發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，治療效果差。近年發(fā)現(xiàn)雷帕霉敏感蛋白為多個信號通路的交點(diǎn)，其中mTORC1（mTOR-Raptor）主要由mTOR和mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（Raptor）組成，調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝、生長、增殖和細(xì)胞周期等。本研究主要對mTOR-Raptor調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的機(jī)制進(jìn)行研究，為前列腺癌的分子靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

人前列腺癌癌DU145細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，Raptor-shRNA慢病毒載體構(gòu)建由上海吉凱生物科技公司完成，E-cadherin， β-catenin， N-cadherin和vimentin和Raptor抗體購自CST公司，RhoA和 Rac1活性試劑盒購自 Millipore公司。Transwell小室購自Corning公司，Matrigel膠購自BD公司。

二、方法

（一）細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺癌DU145培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，0.25%的胰蛋白酶消化傳代，選取對數(shù)生長期DU145細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（二）篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Raptor-shRNA DU145細(xì)胞株

依照Sarbassov等［2］設(shè)計Raptor-shRNA序列，由上海吉凱基因技術(shù)有限公司合成、純化及測序。人raptor-shRNA上游序列為：CcggAGGGCCCTGCTAC TCGCTTTTCTCGAGAAAAGCGAGTAGCAGGGCC CTTTTTTg；下游序列為：aattcaaaaaAGGGCCCTGC TACTCGCTTTTCTCGAGAAAAGCGAGTAGCAGG GCCCT。篩選Raptor -shRNA有效靶點(diǎn)，構(gòu)建RaptorshRNA慢病毒載體，Raptor-shRNA慢病毒包裝及滴度測定，篩選Raptor-shRNA穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆，驗(yàn)證穩(wěn)定表達(dá)Raptor-shRNA慢病毒載體的DU145細(xì)胞成功篩選。

（三）Transwell實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)定表達(dá)RaptorshRNA前列腺癌 DU145細(xì)胞侵襲能力

用Matrigel膠l：8稀釋液鋪滿Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。重懸、調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/L細(xì)胞至無血清培養(yǎng)基，加入transwell小室，下室加入含胎牛血清的培養(yǎng)基；細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，風(fēng)干，加入結(jié)晶紫染色，照相，計數(shù)。

（四）Western Blot檢測E-cadherin， β-catenin，N-cadherin和vimentin表達(dá)

提取各組細(xì)胞總蛋白，Western Blot檢測表達(dá)情況，按全蛋白提取試劑盒操作提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量，蛋白上樣30 μg/孔電泳，半干法轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉2h，E-cadherin（1：500），β-catenin（1：500），N-cadherin（1：500），vimentin（1：500）和Raptor（1：400）抗體和鼠抗人β-actin抗體（1：1000）4℃孵育過夜，室溫孵育1 h后ECL發(fā)光液檢測。

（五）RhoA活性測定

采用Pull-down法，按照RhoA活性測定試劑盒RhoA Assay Kit說明，采用1：500抗RhoA抗體，應(yīng)用Westem blot方法檢測各組DU145細(xì)胞的總RhoA和活性RhoA蛋白。

（六）統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Raptor-shRNA DU145細(xì)胞株成功建立

以PCR陽性克隆進(jìn)行測序，結(jié)果顯示pGCSILPURO-siRNA-Raptor與引物中上游序列完全一致，證明Raptor-shRNA構(gòu)建成功。測序結(jié)果截圖如下（圖1）。

圖1 測序結(jié)果與目的基因?qū)Ρ蕊@示結(jié)果完全一致，證實(shí)慢病毒載體構(gòu)建成功

二、驗(yàn)證轉(zhuǎn)染Raptor-shRNA的效果

Raptor-shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞， Wester Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞中Raptor蛋白含量較正常組DU145細(xì)胞明顯下降（P＜0.01）。證明成功建立Raptor-shRNA DU145細(xì)胞株（圖2）。

三、Raptor調(diào)節(jié)前列腺癌 DU145細(xì)胞的侵襲能力

圖2 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染Raptor-shRNA的效果1： 對照組； 2： 轉(zhuǎn)染Raptor-shRNA組

Transwell結(jié)果顯示正常組和正常對照組DU145細(xì)胞侵襲能力無明顯差異（P＞0.05），而轉(zhuǎn)染Raptor-shRNA的前列腺癌 DU145細(xì)胞侵襲能力顯著下降（P＜0.01）（圖3）。

四、Western Blot檢測E-cadherin， β-catenin，N-cadherin，vimentin和RhoA表達(dá)

WB結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Raptor-shRNA的DU145細(xì)胞株中E-cadherin和 β-catenin表達(dá)明顯增加（P＜0.05），而N-cadherin和vimentin的表達(dá)明顯下降（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染Raptor-shRNA的DU145細(xì)胞株中RhoA活性明顯下降（P＜0.05），而總的RhoA無明顯差異（P＞0.05）（圖4）。

圖3 3組DU145侵襲細(xì)胞實(shí)驗(yàn)A： 各組DU145細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)； B： *P＜0.01， 正常對照組與轉(zhuǎn)染Raptor-shRNA的DU145細(xì)胞侵襲能力比較

圖4 E-cadherin， β-catenin， N-cadherin，vimentin和RhoA表達(dá)

討 論

mTOR為哺乳動物雷帕霉敏感蛋白，有mTORC1（mTOR-raptor）和mTORC2（mTOR-rictor）兩種復(fù)合體形式，在細(xì)胞正常的生長代謝過程中發(fā)揮不可替代的作用。mTORC1主要促進(jìn)蛋白合成和細(xì)胞周期進(jìn)級，還可以與雷帕霉素高度結(jié)合［3］； mTORC2在組織器官肌動蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞存活中起主要作用［4］。近年來發(fā)現(xiàn)，mTOR的過度活化參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

上皮細(xì)胞在一些因素在的作用下，失去極性和細(xì)胞與細(xì)胞間緊密和黏附連接，獲得侵襲和游走遷移能力，變成具備間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特性的細(xì)胞，這種變化稱為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），是惡性腫瘤發(fā)展過程中侵襲和轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制［5］。EMT最重要的特征是上皮屬性的丟失（E-cadherin和β-catenin下調(diào)）和間質(zhì)屬性的獲得（N-cadherin和vimentin上調(diào)），同時伴有細(xì)胞黏附能力下降，極性改變、骨架改變。通過這些蛋白表達(dá)和結(jié)構(gòu)改變，腫瘤細(xì)胞遷移和運(yùn)動能力增強(qiáng)，脫離失巢凋亡的束縛，獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力［6］?，F(xiàn)有大量研究表明，EMT現(xiàn)象存在于前列腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中，是前列腺癌晚期轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一，但其關(guān)鍵機(jī)制目前仍然不清［7］。

大量研究表明mTOR與EMT密切相關(guān)，mTOR通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤EMT，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［8，9］。為了研究mTORC1對前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用，我們沉默了mTORC1中Raptor，使用Transwell研究沉默Raptor后前列腺癌的侵襲能力，結(jié)果顯示沉默Raptor后前列腺癌 DU145細(xì)胞侵襲能力顯著下降，這說明Raptor調(diào)節(jié)前列腺癌EMT。由于EMT發(fā)生變化時表現(xiàn)在上皮屬性和間質(zhì)屬性的標(biāo)志物發(fā)生改變，為了進(jìn)一步研究沉默Raptor后是否調(diào)控前列腺癌EMT，我們研究沉默Raptor后前列腺癌DU145細(xì)胞的中E-cadherin、β-catenin、N-cadherin和vimentin的變化。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Raptor-shRNA的DU145細(xì)胞株中E-cadherin和 β-catenin表達(dá)明顯增加（P＜0.05），而N-cadherin和vimentin的表達(dá)明顯下降（P＜0.05），這進(jìn)一步說明Raptor調(diào)控前列腺癌EMT。

以往的大量研究顯示RhoA是調(diào)控癌癥侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白，包括細(xì)胞間黏附和細(xì)胞骨架形成等［10］。為了研究Raptor調(diào)控前列腺癌EMT的作用機(jī)制，我們檢測轉(zhuǎn)染Raptor-shRNA的前列腺癌DU145細(xì)胞株中RhoA的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Raptor-shRNA后，總的RhoA無明顯變化（P＞0.05），而RhoA活性明顯下降（P＜0.05），這說明了Raptor調(diào)控前列腺癌EMT是通過RhoA信號途徑的。

晚期前列腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，其發(fā)病機(jī)制不清，治療效果差，目前還沒有有效的治療手段阻止前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移。我們的研究表明Raptor調(diào)控前列腺癌EMT機(jī)制是通過RhoA信號途徑的，為晚期前列腺癌的靶向治療提供依據(jù)。

1 Siegel R， Ma J， Zou Z， et al. Cancer statistics， 2014. CA Cancer J Clin 2014， 64（1）： 9-29

2 Sarbassov DD， Guertin DA， Ali SM， et al. Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex. Science 2005； 307（5712）： 1098-1101

3 Sengupta S， Peterson TR， Laplante M， et al. mTORC1 controls fasting-induced ketogenesis and its modulation by ageing. Nature 2010； 468（7327）： 1100-1104

4 Laplante M， Sabatini DM. mTOR signaling in growth control and disease. Cell 2012； 149（2）： 274-293

5 Christofori G. New signals from the invasive front. Nature 2006； 441（7092）： 444-450

6 Polyak K， Weinberg RA. Transitions between epithelial and mesenchymal states： acquisition of malignant and stem cell traits. Nat Rev Cancer 2009； 9（4）： 265-273

7 Nauseef JT， Henry MD. Epithelial-to-mesenchymal transition in prostate cancer： paradigm or puzzle？ Nat Rev Urol 2011； 8（8）： 428-439

8 Shorning BY， Griffiths D， Clarke AR. Lkb1 and Pten synergise to suppress mTOR-mediated tumorigenesis and epithelial-mesenchymal transition in the mouse bladder. PLoS One 2011； 6（1）： e16209

9 Gulhati P， Bowen KA， Liu J， et al. mTORC1 and mTORC2 regulate EMT， motility， and metastasis of colorectal cancer via RhoA and Rac1 signaling pathways. Cancer Res 2011； 71（9）： 3246-3256

10 Burridge K， Wennerberg K： Rho and Rac take center stage. Cell 2004； 116（2）： 167-179

（2015-05-18收稿）

Raptor may be involve in regulation of EMT in prostate cancer

Yu Yang， Zhang Lusheng
Department of Urology， the First College of Clinical Medical Science，
China Three Gorges University.Yichang Central People's Hospital， Hubei Yichang 443003， China

Objective To analyze the roles of the Raptor in regulation of EMT in prostate cancer and explore its mechanism. Methods Du145 cells with LV- raptor-shRNA were rst established. The invasive abilities of the infected Du145 cells with LV-raptor-shRNA were measured by a transwell assay. The expressions of E-cadherin， β-catenin，N-cadherin， vimentin as well as the RhoA activity were detected by Western Blot in Du145 cells with LV- raptor-shRNA. Results The Du145 cells with LV-raptor-shRNA were successfully constructed， the invasive ability of Du145 cells with LV-raptor-shRNA was signi cantly decreased （P＜0.01）， the expression levels of E-cadherin， β-catenin and the activity of RhoA in Du145 cells with raptor-shRNA were all lower than those of the control cells. However， the expression levels of N-cadherin and vimentin were higher than those of the control cells. Conclusion Raptor may regulate EMT in prostate cancer through activating RhoA signaling pathway.

prostatic neoplasms； epithelial-mesenchymal transition； raptor

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.07.006

R 737.25