李莉莉，唐 紅，*，魏晉梅，王世全

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測(cè)試中心，甘肅蘭州 730070；3.臨夏州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅臨夏 731100）

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）屬毛茛科芍藥屬灌木，是我國(guó)特有的著名觀賞及藥用植物，在我國(guó)有悠久的栽培歷史，河南洛陽、山東菏澤、安徽銅陵、陜西漢中、四川彭縣、甘肅蘭州等地是牡丹的主要產(chǎn)地[1]，其中，分布于甘肅的紫斑牡丹（Paeonia rockiiT.Honget J.J.Li）是中國(guó)牡丹第二大栽培品種群，具有較高的觀賞價(jià)值及耐旱、抗寒的特性。牡丹籽是牡丹的成熟種子，是生產(chǎn)丹皮的主要副產(chǎn)品，含油豐富，且富含亞麻酸和亞油酸[2]。2011年衛(wèi)生部批準(zhǔn)將牡丹籽油作為新資源食品[3]，這標(biāo)志著牡丹籽油將進(jìn)入人們的日常生活。

目前，提取牡丹籽油的工藝主要有超聲輔助提取法、超臨界CO2流體提取、微波提取和有機(jī)溶劑提取。史國(guó)安等采用超臨界CO2流體提取法的出油率為28.86%[4]，超聲輔助提取法的出油率為24.12%[5]。易軍鵬、朱文學(xué)等用微波提取牡丹籽出油率為24.52%[6]。張萍采用有機(jī)溶劑提取牡丹籽出油率為23.76%[7]。用這些方法提取牡丹籽的出油率差異較大，主要是由于不同的提油方法及不同品種所導(dǎo)致，另外牡丹籽油的功能性成分也有待于深入研究和開發(fā)利用。本研究采用提取法結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)紫斑牡丹籽油的化學(xué)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并運(yùn)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對(duì)籽油的脂肪酸成分進(jìn)行分析和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫斑牡丹籽 甘肅省榆中縣和平牡丹園提供的30年生紫斑牡丹品種藍(lán)荷；正己烷、14%三氟化硼甲醇溶液、無水硫酸鈉 均為分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；干磨機(jī) 廣東德爾電器有限公司；RE-52C旋蒸蒸發(fā)器 鄭州市亞榮儀器有限公司；DB-23石英毛細(xì)管柱 60 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)Agilent公司；Agilent6890N GC-5973NMSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS） 美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫斑牡丹籽油提取工藝流程 紫斑牡丹籽→干燥（40℃）→去皮→粉碎→浸泡（正己烷）→恒溫水浴→過濾→減壓濃縮（40℃水浴旋蒸完全）→紫斑牡丹籽油。因?yàn)檎和榈姆悬c(diǎn)低，為了防止大量揮發(fā)，在提取過程中均加裝冷凝裝置。

式中：m1—干燥后燒瓶?jī)糁?，g；m2—干燥后提取物和燒瓶總重，g；m—樣品的質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 選取籽粒粉碎時(shí)間、料液比、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以出油率為指標(biāo)，確定各因素的優(yōu)化區(qū)間。

籽粒粉碎時(shí)間篩選：稱取50 g去皮牡丹籽，分別在粉碎機(jī)里粉碎30、60、90、120、150 s后按料液比1∶4 g/mL加入200 mL的正己烷，在50 ℃水浴里提取5 h，過濾后經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮、恒重，計(jì)算紫斑牡丹籽出油率。

水浴溫度的篩選：稱取50 g去皮牡丹籽，籽粒粉碎時(shí)間60 s，按料液比1∶4 g/mL加入200 mL的正己烷，分別在30、40、50、60、70 ℃下提取5 h，過濾后經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮、恒重，計(jì)算紫斑牡丹籽出油率。

提取時(shí)間的篩選：稱取50 g去皮牡丹籽，在籽粒粉碎時(shí)間60 s，水浴溫度50 ℃，料液比1∶4 g/mL的條件下，分別提取4、5、6、7、8 h，過濾后經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮、恒重，計(jì)算紫斑牡丹籽出油率。

料液比的篩選：稱取50 g去皮牡丹籽，在籽粒粉碎時(shí)間60 s，水浴溫度50℃，提取時(shí)間5 h的條件下，分別按1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 g/mL加入料液比，過濾后經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮、恒重，計(jì)算紫斑牡丹籽出油率。

1.2.3 GC-MS分析 甲酯化：稱0.5 g油脂，加入14%三氟化硼甲醇溶液8 mL于90℃水浴上回流90 min，每15 min振搖一次，在冰水浴上冷卻后加入9 mL水和9 mL正己烷，離心10 min，旋轉(zhuǎn)濃縮，甲醇定容，無水硫酸鈉除水[8]。色譜條件：色譜柱：DB-23石英毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口：250 ℃，分流比：90∶1；進(jìn)樣量：1 μL；載氣為He氣，柱流速1 mL/min；升溫程序：初溫140℃，保持4 min，4℃/min升溫至230℃，保持15 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，電子轟擊能70 eV，掃描范圍15～550 m/z，輔助溫度230 ℃[9]。

1.3 響應(yīng)面法優(yōu)化分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert 8.05軟件，根據(jù)旋轉(zhuǎn)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[10-11]，以提取溫度、料液比、提取時(shí)間三個(gè)因素為自變量，分別用A（提取溫度）、B（料液比）、C（提取時(shí)間）表示3個(gè)因素，并以1.68、l、0、-1、-1.68分別代表變量的水平，以紫斑牡丹籽出油率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素五水平共20組實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。采用多元回歸設(shè)計(jì)方法，擬合二次多項(xiàng)模型的中心組合設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（x±SD）。采用Excel 2007統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)整理、分析與作圖，運(yùn)用SPSS 19.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平取p＜0.05（差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)浸取牡丹籽油單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 籽粒粉碎時(shí)間對(duì)出油率的影響 由圖1可知，起初紫斑牡丹籽出油率隨籽粒粉碎時(shí)間延長(zhǎng)而增大，在粉碎時(shí)間延長(zhǎng)到60 s后出油率達(dá)到最大，再延長(zhǎng)時(shí)間，出油率趨于平穩(wěn)?？赡苁怯捎诜鬯榱６仍叫?，溶劑與物料的接觸面積越大，越有利于提高提取率。但是粉碎時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致牡丹籽粉在粉碎機(jī)中板結(jié)成塊，也有可能是粉碎的粒度過小，原料的堆積密度增大，溶劑的擴(kuò)散阻力增大，從而影響了提取的效果，因此選取粉碎時(shí)間60 s進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析。對(duì)60 s粉碎的物料過篩正好可以過40目篩。

圖1 籽粒粉碎時(shí)間對(duì)紫斑牡丹籽出油率的影響Fig.1 Effect of the grain crushing time on extraction yield of P.rockii seed oil

2.1.2 提取溫度對(duì)紫斑牡丹出油率的影響 牡丹籽出油率隨著提取溫度的升高而增大（見圖2），在50℃時(shí)達(dá)到最大值，隨后開始急劇下降。這可能是由于隨著溫度的升高，原料在正己烷里加大了擴(kuò)散速率，但是正己烷容易揮發(fā)，如果處理溫度過高，溶劑揮發(fā)加劇，反而減少了正己烷與原料的接觸面積，降低了擴(kuò)散速率，并且超過一定溫度會(huì)使牡丹籽油組分分解，導(dǎo)致牡丹籽出油率下降[12]，溫度過低原料在溶劑里發(fā)生很小的作用也不利于提取。因此選取40～60℃的溫度范圍進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析。

圖2 提取溫度對(duì)紫斑牡丹籽出油率的影響Fig.2 Effect of the leaching temperature on extraction yield of P.rockii seed oil

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)牡丹籽出油率的影響 由圖3可知，紫斑牡丹籽出油率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而增大，提取時(shí)間延長(zhǎng)到5 h后牡丹籽出油率達(dá)到最大值，再延長(zhǎng)時(shí)間，出油率開始有所下降，因此選擇4～6 h的時(shí)間范圍進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析。

圖3 提取時(shí)間對(duì)紫斑牡丹籽出油率的影響Fig.3 Effect of the leaching time on extraction yield of P.rockii seed oil

2.1.4 液料比對(duì)紫斑牡丹籽出油率的影響 由圖4可知，紫斑牡丹籽出油率隨著料液比的增大而增大，料液比大于1∶6 g/mL時(shí)，紫斑牡丹籽出油率的增加趨于緩慢，繼續(xù)增大液料比對(duì)紫斑牡丹籽出油率影響不明顯。這可能是由于物料在溶液中具有一定的溶解度，在溶解達(dá)到飽和時(shí)，過量的物料不再溶解，出油率不再提高[13]。如果此時(shí)再增加溶劑的量就會(huì)造成一定的浪費(fèi)。因此選取1∶4～1∶8 g/mL的料液比范圍進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析。

圖4 料液比對(duì)紫斑牡丹籽出油率的影響Fig.4 Effect of the solid ratio to liquid on extraction yield of P.rockii seed oil

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化紫斑牡丹籽油提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 利用Design-Expert 8.05軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，根據(jù)中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇提取時(shí)間、料液比、提取溫度3個(gè)因素所確定的水平范圍，以紫斑牡丹籽出油率為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素5水平共20個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)以隨機(jī)次序進(jìn)行，結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型建立及方差分析 采用Design-Expert 8.05軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，建立二次多項(xiàng)式回歸模型方程為：Y=30.82+2.17A+1.02B+0.62C+1.46AB-0.14AC+0.33BC-5.26A2-5.52B2+B2-2.07C2。

表2 響應(yīng)面法提取工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Optimization of extraction process for response surface method design and the results

模型利用Design-Expert 8.05軟件的ANOVA分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)，回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)影響的顯著性由F檢驗(yàn)來判定。概率p值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由表3可知，擬合模型p＜0.0l，說明回歸模型極顯著。模型中的A、A2和B2達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），B、C、AB對(duì)Y的影響達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the developed regression model

注：**表示極顯著（p＜0.01），*表示顯著（p＜0.05）。

圖5 提取時(shí)間和料液比對(duì)紫斑牡丹籽出油率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface for the effects of leaching time and solid-liquid ratio on the extraction yield of P.rockii seed oil

圖6 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)紫斑牡丹籽出油率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface for the effects of leaching temperature and leaching time on the extraction yield of P.rockii seed oil

圖7 提取溫度和料液比對(duì)紫斑牡丹籽出油率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface for the effects of leaching temperature and solid-liquid ratio on the extraction yield of P.rockii seed oil

該方程的決定系數(shù)R2=0.9763，說明該方程與實(shí)際情況擬合良好，而失擬項(xiàng)p＞0.05不顯著，說明模型擬合度良好。所選的3個(gè)因素對(duì)紫斑牡丹籽出油率的影響順序?yàn)樘崛囟龋ˋ）＞提取時(shí)間（C）＞料液比（B）。

2.3 最佳提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

把籽粒粉碎60 s，以紫斑牡丹籽出油率為響應(yīng)值，通過Design-Expert 8.05軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到最佳提取工藝為提取時(shí)間5.2 h、料液比1∶6.2 g/mL、提取溫度（52±1）℃，預(yù)測(cè)的紫斑牡丹籽油提取率為31.21%。為了檢測(cè)該工藝的合理性，可取最優(yōu)條件為紫斑牡丹籽去皮粉碎60 s，選取提取時(shí)間5.2 h、料液比1∶6.2 g/mL、提取溫度（52±1）℃進(jìn)行放大驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，做3次平行取其均值，在此條件下經(jīng)過驗(yàn)證紫斑牡丹籽出油率達(dá)31.36%，與理論預(yù)測(cè)值31.21%接近，證明了方程可靠性與響應(yīng)面分析法的有效性。

2.4 紫斑牡丹籽油GC-MS定性和定量分析

運(yùn)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對(duì)本實(shí)驗(yàn)所得的紫斑牡丹籽油進(jìn)行分析，GC-MS所得總離子流圖見圖8，由圖8可知，色譜共分離出18個(gè)峰表明紫斑牡丹籽油主要是由18種化合物組成，對(duì)總離子流圖的各峰進(jìn)行質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索、人工譜圖解析最終確定出紫斑牡丹籽油中的脂肪酸成分，并利用峰面積歸一化法確定了各組分在油中的相對(duì)含量。

圖8 紫斑牡丹籽油脂肪酸甲酯的GC-MS總離子流色譜圖Fig.8 GC-MS total ion chromatogram ofkerneloil from P.rockii seed

紫斑牡丹籽油中脂肪酸組成分析鑒定結(jié)果見表4，紫斑牡丹籽油中共檢測(cè)出18種脂肪酸成分，主要含有亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸，其中亞麻酸是其主要成分，占總脂肪酸含量的65.23%。紫斑牡丹籽油中含有不飽和脂肪酸10種占其脂肪酸總量的96.62%，飽和脂肪酸占其總量的3.38%。

表4 紫斑牡丹籽油脂肪酸甲酯衍生物的GC-MS分析結(jié)果Table 4 Identification results of chemical constituents for the kernel oil of P.rockii seed

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，戚軍超等[14]采用有機(jī)溶劑經(jīng)索氏提取采用三氯化硼甲醇甲酯化后，利用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)牡丹籽油成分進(jìn)行分析，共鑒定37種成分，結(jié)果表明牡丹籽油富含不飽和脂肪酸，主要為亞麻酸、油酸、亞油酸，其中不飽和脂肪酸含量為83.42%。易軍鵬等[6]采用微波提取工藝，牡丹籽油的出油率為24.52%，GC-MS分析結(jié)果表明牡丹籽油中富含不飽和脂肪酸，其中亞油酸和亞麻酸的含量分別為24.57%和67.13%。易軍鵬等[5]利用超臨界CO2提取牡丹籽油，牡丹籽出油率可達(dá)到24.22%，GC-MS結(jié)果表明牡丹籽油中富含不飽和脂肪酸，其中亞油酸和亞麻酸的含量分別為23.34%和66.85%。周海梅等[9]用索氏提取法獲得牡丹籽油，經(jīng)皂化、甲酯化后用毛細(xì)管GC-MS法對(duì)其脂肪酸成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明，牡丹籽油中共有17種脂肪酸成分，主要為亞麻酸、油酸、亞油酸等，不飽和脂肪酸占83.05%。由上述研究結(jié)果可以看出，牡丹籽油中不飽和脂肪酸含量和亞麻酸、亞油酸含量均較高，雖因材料來源，提取方法以及檢測(cè)方法等不同而結(jié)果不盡一致，但是脂肪酸組成及其含量均符合我國(guó)健康食用油標(biāo)準(zhǔn)[3]。

3 結(jié)論與討論

溶劑提取法是把原料浸于溶劑中使油脂溶解于溶劑形成混合油，然后將雜質(zhì)分離。本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定籽粒粉碎時(shí)間為60 s，通過三因素五水平的響應(yīng)面分析法對(duì)紫斑牡丹籽油化學(xué)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。得到最佳提取工藝為提取時(shí)間5.2 h、料液比1∶6.2 g/mL、溫度（52±1）℃，預(yù)測(cè)的牡丹籽出油率為31.21%。用以上方法優(yōu)化工藝后放大實(shí)驗(yàn)得到紫斑牡丹籽出油率為31.36%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果適合于紫斑牡丹籽油提取工藝，放大實(shí)驗(yàn)為規(guī)?；习吣档ぷ延突瘜W(xué)提取工藝提供了數(shù)據(jù)參考。紫斑牡丹籽油中共檢測(cè)出18種脂肪酸成分，主要含有亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸，其中亞麻酸是其主要成分，占總脂肪酸含量的65.23%。紫斑牡丹籽油中含有不飽和脂肪酸10種，占其脂肪酸總量的96.62%，飽和脂肪酸占其總量的3.38%。分析結(jié)果可知，紫斑牡丹籽油脂肪酸組成簡(jiǎn)單，并且多是不飽和脂肪酸，特別是亞麻酸的含量高居首位。該實(shí)驗(yàn)方法與以往文獻(xiàn)報(bào)道的臨界CO2提取法[5]和微波提取工藝[6]相比出油率較高；溶劑與水不互溶，沸點(diǎn)低易回收；操作方便，能夠滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。但毛油中會(huì)存在有機(jī)溶劑殘留[15]，有待進(jìn)一步改善。

紫斑牡丹籽油中富含的亞麻酸是構(gòu)成細(xì)胞膜和生物酶的基礎(chǔ)物質(zhì)，對(duì)人體健康起決定性作用。紫斑牡廣泛分布于我國(guó)的西北地區(qū)，品種資源十分豐富，花朵單瓣品種繁多，結(jié)子率高、籽實(shí)油用性強(qiáng)。且在海拔2000 m以上的高寒、干旱、貧瘠山嶺、荒地上，年降雨量300 mm生長(zhǎng)良好，適宜在北方干旱地區(qū)推廣。我國(guó)部分省區(qū)已在油用牡丹品種選育、苗木繁育、產(chǎn)品研發(fā)和深加工等方面取得了重要進(jìn)展，牡丹籽油深加工正向醫(yī)藥工業(yè)、食品加工、高級(jí)化妝品、潤(rùn)滑油等眾多領(lǐng)域延伸，成為新興資源，市場(chǎng)潛力巨大，對(duì)紫斑牡丹籽的綜合利用可滿足人們對(duì)高品質(zhì)油產(chǎn)品的需求。

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