黃俊偉，彭睆睆，崔 春，王智榮

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510641）

米曲霉是我國傳統(tǒng)釀造業(yè)使用的菌種，被美國FDA認可為GRAS級別，已被廣泛運用到多種傳統(tǒng)調(diào)味品、新型呈味基料及酶制劑的開發(fā)中。制曲的目的是使米曲霉在原料上充分生長，分泌發(fā)酵所需各種酶類，在后續(xù)的發(fā)酵中將大分子物質(zhì)降解成可溶性小分子[1]。在米曲霉分泌的堿性蛋白酶和中性蛋白酶作用下，大分子的蛋白質(zhì)被降解成多肽和游離氨基酸。因此，蛋白酶活是評價成曲質(zhì)量的重要指標，會對原料蛋白質(zhì)利用率和成品質(zhì)量有重要影響[2]。傳統(tǒng)調(diào)味品如醬油的主要原料是大豆或者豆粕，近年來利用其他原料制備調(diào)味品或呈味基料的研究報道也越來越多，例如夏克勝等[3]利用馬氏珍珠貝肉固體制曲制備呈味基料，探討了制曲過程中酶活與氮源營養(yǎng)代謝的關系；藺立杰等[4]利用響應面法優(yōu)化了核桃醬油的制曲工藝，利用全小麥進行制曲，系統(tǒng)研究制曲條件對成曲酶活影響的研究鮮見報道。與大豆相比，小麥蛋白質(zhì)谷氨酸含量極高，是生產(chǎn)高品質(zhì)調(diào)味品的優(yōu)質(zhì)原料[5-6]。

本文以米曲霉作為菌種，全小麥作為制曲基料，以成曲的中性和酸性蛋白酶活為評價指標，全面考察了米曲霉曲精來源、原料粗細度、曲料初始水分含量、制曲濕度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對小麥曲的影響并優(yōu)化了其制曲工藝，以期為新型呈味基料和調(diào)味品的開發(fā)生產(chǎn)提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥 含碳水化合物75.2%，蛋白質(zhì)11.9%，粗脂肪1.3%，購買于市場；光明牌曲精 上海釀造一廠；鼎鑫牌曲精 鼎鑫釀造食品科學研究所；企業(yè)曲精廣東佛山醬油廠；實驗室曲精 實驗室分離制得，所有曲精均為滬釀3.042米曲霉孢子粉，質(zhì)量指標滿足：孢子數(shù)≥100億/克干基，孢子發(fā)芽率≥80%，水分≤10%；福林試劑 參照SB/T 10317-1999配制；干酪素 生化試劑；其余均為分析純。

FA2004分析天平 上海天平儀器廠；JYS-900型立式殺菌鍋 利宏輕工機械有限公司；HPX-9052MBE型恒溫培養(yǎng)箱 常州諾基儀器有限公司；101A-0型數(shù)顯電熱鼓風干燥箱 蘇州學森儀器設備有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海申賢恒溫設備廠；GL-21M型高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器公司；DFT200型手提式高速萬能粉碎機 上海精勝科學儀器設備公司；紫外可見UV-2000型分光光度計 尤尼柯（上海）儀器設備公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制曲流程 制曲過程參考黃嬋媛[6]的制曲工藝流程為：

全小麥→焙炒→粉碎→潤水→造?！銮鷾y定蛋白酶活

1.2.2 不同種類曲精對成曲酶活力的影響 取生小麥各250 g，分別在140℃條件下焙炒30 min，粉碎加水至曲料初始水分含量為50%造粒，分別接入鼎鑫牌、光明牌、企業(yè)和實驗室自制四種曲精0.5‰（以加水后小麥重量計）制曲，自然濕度條件下培養(yǎng)44 h出曲，測定成曲中性和酸性蛋白酶活力。

1.2.3 原料粗細度對成曲酶活力的影響 焙炒后的小麥粉碎物通過10、20和40目的篩子，以實驗1.2.2確定的光明牌曲精作為菌種，自然濕度條件下培養(yǎng)44 h出曲，測定成曲中性和酸性蛋白酶活力。

1.2.4 濕度對成曲酶活力的影響 按上述所確定的種曲來源和原料粉碎細度，研究自然條件不控制濕度（恒濕RH 90%），對照組（控濕）對成曲酶活力影響。對照組（控濕）是指0～24 h為95%的濕度；24～36 h為90%濕度；36～40 h為80%的濕度；40～44 h為70%的濕度。大曲培養(yǎng)44 h出曲，測定成曲中性和酸性蛋白酶活力。

1.2.5 曲料初始水分含量對成曲酶活力的影響 按上述所確定的條件，加水使各曲料初始水分含量分別為45%、47%、49%、51%、53%、55%，控濕培養(yǎng)44 h出曲，測定成曲中性和酸性蛋白酶活力。

1.2.6 培養(yǎng)時間對成曲酶活力的影響 根據(jù)以上單因素實驗確定的種曲來源，原料粗細度，培養(yǎng)濕度和曲料初始水分含量為制曲條件，從制曲36 h開始，每隔4 h取一次樣，連續(xù)取樣6次直至56 h出曲，測定成曲中性和酸性蛋白酶活力。

1.2.7 培養(yǎng)溫度對成曲酶活力的影響 根據(jù)以上確定的培養(yǎng)條件，分別以28、30、32℃初始培養(yǎng)溫度培養(yǎng)，控濕培養(yǎng)48 h出曲，測定成曲中性和酸性蛋白酶活力。

1.3 分析方法

1.3.1 水分含量的測定 直接干燥法，參考GB5497-85[7]。

1.3.2 蛋白酶活的測定 參考SB/T 10317-1999[8]，采用福林酚法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有測試重復進行三次，使用SPSS 14.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 曲精種類對成曲酶活的影響

曲精是經(jīng)過試管培養(yǎng)、三角瓶培養(yǎng)、進一步擴大培養(yǎng)后再分離得到的處于休眠狀態(tài)的米曲霉孢子，具有使用方便、容易保存、與種曲相比質(zhì)量更穩(wěn)定等優(yōu)點，目前已被許多調(diào)味品生產(chǎn)企業(yè)廣泛使用[9]。不同品牌曲精成曲蛋白酶活的影響如圖1所示。盡管本實驗所用的曲精均為滬釀3.042米曲霉孢子，但是不同成曲間蛋白酶活存在顯著性差異（p＜0.05）。光明牌成曲各項酶活力最高，其中性蛋白酶為1044 U/g，酸性蛋白酶為322 U/g；鼎鑫牌成曲的中性蛋白酶酶活力最低，僅為946 U/g；實驗室成曲具有最低的酸性蛋白酶活，其酶活為226 U/g。有研究表明，曲精是多種微生物的混合體，不同品牌曲精及種曲微生物分布、水分活度、水分含量和蛋白酶活存在顯著性差異[10]，這與本文結(jié)果一致。綜合考慮中性和酸性蛋白酶活，選用光明牌曲精來進行后續(xù)的工藝優(yōu)化研究。

圖1 曲精種類對成曲蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of A.oryzae HN 3.042 spores type on the enzyme activity of koji

2.2 原料粗細度對成曲蛋白酶活的影響

原料粉碎的目的是增加米曲霉的繁殖面積和酶的作用面積。曲料固體顆粒具有合適的比表面積，既有利于曲霉菌的呼吸、散熱，又可使醬料生產(chǎn)過程簡單易行，易于實現(xiàn)工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。原料粗細度對成曲蛋白酶活的影響結(jié)果如圖2所示。不同粗細度成曲其蛋白酶活存在顯著性差異（p＜0.05），隨著原料粉碎程度的增加，成曲蛋白酶活呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。20目過篩的成曲其中性和酸性蛋白酶活最高，分別為1160 U/g和333 U/g，酶活較10目篩成曲明顯增加，這可能是因為適度粉碎原料可以提高原料吸水量，增加原料的表面積，有利于米曲霉菌絲深入原料內(nèi)部，提高成曲酶活。當使用40目過篩原料制曲時，其中性和酸性蛋白酶活反而降低，這可能是因為原料過細吸水易結(jié)塊，制曲過程由于通風不便易燒曲，降低了成曲酶活。因此，選用20目過篩的原料來進行后續(xù)優(yōu)化實驗。

圖2 原料粗細度對成曲酶活力的影響Fig.2 Effect of the raw material thickness degrees on the enzyme activity of koji

2.3 培養(yǎng)濕度對成曲蛋白酶活的影響

米曲霉的整個生長階段可以分為4個階段：孢子發(fā)芽期、菌絲生長期、菌絲繁殖期、孢子著生期[3]，在不同的生長階段米曲霉對環(huán)境條件的要求也不盡相同，培養(yǎng)濕度會對米曲霉的菌絲生長和成曲酶活等產(chǎn)生重要影響。濕度過低，會導致原料制曲過程中由于產(chǎn)熱而水分揮發(fā)；濕度過高，空氣中的水分易在原料上冷凝，成曲容易受到雜菌的污染[11]。培養(yǎng)濕度對成曲蛋白酶活的影響結(jié)果如圖3所示。采用控濕制曲的小麥成曲其中性和酸性蛋白酶活分別高達1449 U/g和388 U/g，較恒濕制曲組酶活分別提高了11.29%和28.90%，這說明控濕制曲可以有效提高成曲酶活，在實際生產(chǎn)過程中可以使用具有控濕功能的機械設備來控制制曲濕度，提高成曲質(zhì)量。

圖3 培養(yǎng)濕度對成曲酶活力的影響Fig.3 Effect of culture humidity on the enzyme activity of koji

2.4 曲料初始水分含量對成曲酶活的影響

微生物的生命活動離不開水，曲料中的初始水分含量會對米曲霉的活性有很大的影響，進而影響到成曲的質(zhì)量。一般而言，培養(yǎng)米曲霉的曲料最適初始水分含量在45%～55%之間。曲料初始水分含量過低，會導致曲料潤水程度不夠，曲料在制曲過程中由于微生物產(chǎn)熱而造成曲料過干微生物生長受阻，成曲酶活下降；另一方面，曲料水分過少會導致米曲霉繁殖不充分，甚至提前結(jié)孢子，變成老曲，菌絲瘦段，成曲酶活不高。初始水分過多，會降低曲料的通風效果，導致酶活下降。另外，水分過多一方面會導致原料中營養(yǎng)物質(zhì)被曲霉過分消耗，另一方面曲料也易受雜菌污染。例如，芽孢桿菌或者產(chǎn)酸菌迅速繁殖會影響米曲霉的繁殖，產(chǎn)生粘曲或酸曲，嚴重影響制曲的質(zhì)量[12]。曲料初始水分含量對成曲酶活的影響如圖4所示。隨著曲料初始水分含量的上升，成曲蛋白酶活呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。在初始水分含量為51%時，成曲的中性和酸性蛋白酶活均為最高，分別達到了1462 U/g和364 U/g。曲料中適當?shù)乃趾磕軌虼龠M米曲霉的生長繁殖，提高成曲的酶活。因此，選用51%初始水分含量來進行后續(xù)的優(yōu)化研究。

圖4 曲料初始水分含量對成曲酶活力的影響Fig.4 Effect of the moisture content on the enzyme activity of koji

2.5 培養(yǎng)時間對成曲蛋白酶活力的影響

中性和酸性蛋白酶活隨固體制曲時間的變化如圖5所示。制曲起始階段，米曲霉剛開始萌芽，然后菌絲開始生長，產(chǎn)生了大量的肉眼可見的白色菌絲，曲料發(fā)白，此時曲中的中性和酸性蛋白酶活處于一個較低的水平。隨著制曲時間的延長，在36 h曲霉孢子開始著生，產(chǎn)酶能力開始旺盛，小麥曲的蛋白酶活急劇增加，曲料呈現(xiàn)淡黃綠色；到48 h大曲酶活達到頂峰，中性和酸性蛋白酶活分別高達1462 U/g和364 U/g，顯著高于其他制曲時間的成曲酶活（p＜0.05），曲料的顏色也逐漸加深，呈現(xiàn)嫩黃綠色。48 h后，隨著制曲時間的延長，米曲霉處于過生長狀態(tài)，中性和酸性蛋白酶活不斷下降。由圖5可知，發(fā)酵時間對中性蛋白酶活的影響很大，而對酸性蛋白的影響較不明顯，綜合考慮兩種蛋白酶活指標，選擇制曲時間48 h為宜。

圖5 培養(yǎng)時間對成曲酶活力的影響Fig.5 Effect of culture time on the enzyme activity of koji

2.6 培養(yǎng)溫度對蛋白酶活的影響

培養(yǎng)溫度是影響大曲蛋白酶活的重要因素，它與米曲霉孢子的萌發(fā)，菌絲體的生長，酶系的分泌及大曲酶活高低關系密切。研究表明，30～35℃是米曲霉的最適生長溫度[13]。培養(yǎng)溫度對蛋白酶活的影響如圖6所示。不同的培養(yǎng)溫度下的成曲酶活存在顯著差異（p＜0.05），隨著培養(yǎng)溫度的提高，成曲中性和酸性蛋白酶活呈不斷上升的趨勢，其中32℃的成曲其蛋白酶活最高。溫度較低時，米曲霉孢子的萌發(fā)速度較慢，菌體生長繁殖受阻，大曲容易感染雜菌，故成曲酶活較低；但是培養(yǎng)溫度較高也會對成曲酶活造成不利影響。一方面，制曲過程中菌株的生長發(fā)育會產(chǎn)出大量的熱，導致成曲品溫上升，通風條件不好的情況下容易出現(xiàn)燒曲現(xiàn)象；另一方面，制曲培養(yǎng)溫度過高，耐高溫的微生物例如根霉等會在曲料上生長，導致大曲出現(xiàn)濃重的氨味。此外，在實驗過程中發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)溫度超過32℃，隨著溫度的升高，曲中營養(yǎng)物質(zhì)被微生物生長繁殖大量消耗，成曲質(zhì)量不斷下降。因此，綜合考慮蛋白酶活、出曲量和雜菌感染情況，選擇制曲溫度為32℃為最優(yōu)條件，此時大曲的中性蛋白酶活為1583 U/g干重，酸性蛋白酶活為497 U/g干重，比黃嬋媛[6]的最優(yōu)條件下的中性和酸性蛋白酶活分別提高了12.75%和4.63%。

圖6 培養(yǎng)溫度對成曲酶活力的影響Fig.6 Effect of culture temperature on the enzyme activity of koji

3 結(jié)論

不同品牌曲精成曲的酶活存在顯著差異，這是因為不同品牌曲精的微生物狀態(tài)不同，孢子的活力和種曲水分含量也不相同；光明牌曲精具有良好的孢子活力，可作為曲精來源。控濕制曲（0～24h RH 95%，24～36h RH 90%，36～40h RH 80%，40～44h RH 70%）可有效提高小麥曲的蛋白酶活，與恒定濕度RH 90%制曲相比，其中性蛋白酶和酸性蛋白酶活分別提高了11.29%和28.90%。通過單因素實驗確定全小麥制曲的最優(yōu)工藝為：焙炒小麥粉碎過20目篩、曲料初始水分含量為51%、培養(yǎng)時間48 h、培養(yǎng)溫度32℃，控濕制曲（即0～24 h濕度95%，24～36 h濕度90%，36～40 h濕度80%，40～44 h濕度70%）。此時大曲的中性和酸性蛋白酶活分別高達1583 U/g干重和497 U/g干重。

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