張清清 郭玲芝 陳劍鋒 鄒 坤 郭志勇

（三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002）

昆蟲內(nèi)生菌因其宿主的特殊環(huán)境，已經(jīng)證明可以產(chǎn)生骨架新穎的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，因而昆蟲內(nèi)生真菌正成為天然產(chǎn)物新的源泉［1－3］.本實(shí)驗(yàn)室對(duì)神農(nóng)架地區(qū)的幾株昆蟲內(nèi)生菌Alternariasp.、Paraconiothyriumbrasiliense、Penicilliumoxalicum等的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了初步研究，分離得到一系列環(huán)肽類、呋喃酮類、聚酮類等化合物，并測(cè)定了它們的藥理活性［4－7］.

本文繼續(xù)對(duì)采自神農(nóng)架地區(qū)的粉蝶科菜粉蝶（PierisrapaeLinne）的內(nèi)生真菌Alternariasp.的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，通過各種色譜技術(shù)和現(xiàn)代波譜技術(shù)分離并鑒定了4個(gè)化合物，確定為4個(gè)混源萜類化合物，并測(cè)定了這4個(gè)化合物的酪氨酸激酶的抑制活性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

X Series 2質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific；Ultimate 3000型DIONEX高效液相色譜儀，美國(guó)DIONEX；高壓滅菌器，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；Ultrashied TM 400MHZ型核磁共振儀，瑞士Bruker；顯微熔點(diǎn)儀（未校正），天津市分析儀器廠.培養(yǎng)基的配制見參考文獻(xiàn)［4］.

1.2 菌種的分離、純化及鑒定

菌株分離方法見文獻(xiàn)［4］，菌株由三峽大學(xué)微生物學(xué)博士涂璇副教授鑒定.

1.3 菌種的發(fā)酵

保藏菌株接種至PDA平皿，培養(yǎng)8d，轉(zhuǎn)移至PDB培養(yǎng)基中為種子液，繼續(xù)培養(yǎng)5d，后接入SDB液體培養(yǎng)基中，100瓶，搖床160r／min，恒溫28℃培養(yǎng)20d.

1.4 代謝產(chǎn)物的提取與分離

發(fā)酵結(jié)束，分離發(fā)酵液和菌絲體，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取3次，濃縮得浸膏10.2g，以硅膠柱層析分離，流動(dòng)相：氯仿－甲醇，梯度洗脫，得7個(gè)餾分段（Ⅰ－Ⅶ）.Ⅶ中的餾分經(jīng) HPLC制備（乙腈－水40%∶60%，v∶v）得到化合物1（6mg）、2（5mg）、3（7mg）和4（10mg）.

圖1 化合物1－4的結(jié)構(gòu)

2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色油狀物，分子式：C21H30O4，ESIMS m／z：347［M ＋ H］＋.1H NMR（CDCl3，400 MHz）δH：3.97（s，H－1a），3.92（s，H－1b），1.61（s，H－2′），5.21（t，J＝7.0Hz，H－3），2.00（m，H－4a），1.91（m，H－4b），1.36（m，H－5），1.90（s，H－6），0.97（s，H－6′），5.30（brs，H－8），2.46（m，H－9a），2.62（m，H－9b），1.42（s，H－10′），2.82（m，H－11），2.16（m，H－12a），2.69（m，H－12b），4.36（m，H－15），1.94（m，H－16a），2.22（m，H－16b），2.26（m，H－17a），2.62（m，H－17b）；13C NMR（CDCl3，100MHz）δC：68.8（C－1），135.3（C－2），13.7（C－2′），125.0（C－3），24.9（C－4），34.7（C－5），30.9（C－6），19.8（C－6′），150.0（C－7），119.7（C－8），45.2（C－9），89.4（C－10），23.6（C－10′），47.1（C－11），14.9（C－12），107.9（C－13），170.7（C－14），66.7（C－15），28.8（C－16），33.6（C－17），197.0（C－18）；以上波譜數(shù)據(jù)，參照文獻(xiàn)［8］，基本一致，確定該化合物為Tricycloalternarene 2a.

化合物2：黃色油狀物，分子式：C21H30O4，ESI－MS m／z：347［M ＋ H］＋.1H NMR（CDCl3，400 MHz）δH：3.98（s，H－1a），3.95（s，H－1b），1.61（s，H－2′），5.23（t，J＝7.0Hz，H－3），2.03（m，H－4a），1.98（m，H－4b），1.48（m，H－5a），1.32（m，H－5b），2.20（s，H－6），0.97（s，H－6′），5.32（br s，H－8），2.43（m，H－9a），2.58（m，H－9b），1.44（s，H－10′），2.79（m，H－11），2.16（m，H－12a），2.73（m，H－12b），2.36（m，H－15a），2.52（m，H－15b），1.74（m，H－16a），2.29（m，H－16b），4.02（m，H－17）；13C NMR（CDCl3，100MHz）δC：68.8（C－1），135.3（C－2），13.7（C－2′），125.4（C－3），24.9（C－4），34.7（C－5），31.1（C－6），20.2（C－6′），150.0（C－7），119.9（C－8），45.1（C－9），88.8（C－10），23.2（C－10′），46.5（C－11），14.9（C－12），105.1（C－13），172.9（C－14），27.8（C－15），29.5（C－16），71.0（C－17），197.7（C－18）；以上波譜數(shù)據(jù)，參照文獻(xiàn)［9］，基本一致，確定該化合物為Tricycloalternarene 2b.

化合物3：黃色油狀物，分子式：C21H30O3，ESIMS m／z：331［M ＋ H］＋.1H NMR（CDCl3，400 MHz）δH：1.63（s，H－1），1.54（s，H－2′），5.03（t，J＝7.0Hz，H－3），1.8l（m，H－4），1.28（m，H－5），1.90（m，H－6），0.95（d，H－6′），5.35（br s，H－8），2.43（m，H－9a），2.58（m，H－9b），1.44（s，H－10′），2.55（m，H－12），4.29（m，H－15），1.93（m，H－16a），2.17（m，H－16b），2.53（m，H－17）；13C NMR（CDCl3，100MHz）δC：25.7（C－1），131.6（C－2），17.7（C－2′），124.5（C－3），25.9（C－4），34.9（C－5），32.3（C－6），20.2（C－6′），151.0（C－7），119.8（C－8），44.9（C－9），88.5（C－10），23.7（C－10′），46.6（C－11），15.3（C－12），108.1（C－13），171.3（C－14），66.5（C－15），28.9（C－16），33.6（C－17），196.2（C－18）；以上波譜數(shù)據(jù)，參照文獻(xiàn)［10］，基本一致，確定該化合物為 Tricycloalternarene 3a.

化合物4：黃色油狀物，分子式：C21H30O3，ESIMS m／z：331［M ＋ H］＋.1H NMR（CDCl3，400 MHz）δH：1.68（s，H－1），1.56（s，H－2′），4.97（t，J＝7.0Hz，H－3），2.53（m，H－4），5.23（t，J＝7.0 Hz，H－5），1.65（s，H－6′），2.78（m，H－7），1.83（m，H－8），1.86（m，H－9a），2.18（m，H－9b），1.37（s，H－10′），1.97（m，H－11），2.15（m，H－12a），2.33（m，H－12b），4.41（m，H－15），2.04（m，H－16a），2.29（m，H－16b），2.35（m，H－17a），2.67（m，H－17b）；13C NMR（CDCl3，100MHz）δC：25.6（C－1），131.5（C－2），17.6（C－2′），123.2（C－3），26.5（C－4），127.3（C－5），133.9（C－6），18.3（C－6′），41.8（C－7），25.（C－8），37.8（C－9），87.8（C－10），22.8（C－10′），43.4（C－11），15.9（C－12），107.9（C－13），167.2（C－14），66.1（C－15），28.9（C－16），33.4（C－17），197.4（C－18）；以上波譜數(shù)據(jù)，參照文獻(xiàn)［11］，基本一致，確定該化合物為Tricycloalternarene F.

3 化合物的藥理活性

近年來，EGFR，VEGFR，c－Met等都已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)［12］，因此本文采用均相時(shí)間分辨熒光技術(shù)，使用HTRF?KinEASE?TK試劑盒測(cè)定了所得化合物對(duì)三種受體酪氨酸激酶（EGFR，VEGFR－1，c－Met）的抑制活性.設(shè)計(jì)陽性組、陰性組、空白組和給藥組四個(gè)組，三種受體酪氨酸激酶的陽性藥分別為Erlotinib、Pazopainib和BMS－777607.陽性藥給藥濃度和化合物1－4的給藥濃度均為200nM，每個(gè)濃度2個(gè)復(fù)孔，測(cè)試結(jié)果表明（見表1），化合物3和4對(duì)三種酪氨酸激酶（EGFR，VEGFR－1，c－Met）具有較強(qiáng)的抑制活性.

表1 化合物1－4對(duì)受體酪氨酸激酶的抑制活性

4 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)前期從Alternariasp.中分離得到7個(gè)化合物，包括4個(gè)環(huán)肽類化合物和3個(gè)聚酮類化合物［4］.本文繼續(xù)對(duì)該菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，得到4個(gè)系列混源萜類化合物，并首次初步測(cè)定了Tricycloalternarene類化合物的受體酪氨酸激酶的抑制活性，測(cè)試結(jié)果表明，化合物3和4對(duì)三種酪氨酸激酶具有較強(qiáng)的抑制活性，為該類混源萜類化合物的活性研究開辟了一條新的途徑.

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