孫文軍 汪鋆植 張 盼 賀海波 黃文峰 張 琳

（1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室 ＆湖北省土家族醫(yī)藥研究所，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002）

齒孔酸（Eburicoic acid）是硫磺菌主要成分之一，具體保肝、抗炎、抗癌等多種活性［3－5］，可衍生為羊毛甾－9－烯，用作有機(jī)合成原料，因此，齒孔酸具有很好的利用前景.本試驗以菌絲產(chǎn)量和齒孔酸含量為指標(biāo)，對硫磺菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基條件進(jìn)行優(yōu)化.

1 材料與儀器

1.1 供試菌種

硫磺菌菌種由三峽旅游職業(yè)技術(shù)學(xué)院王紹柏老師提供.將硫磺菌菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)一周，4℃保藏.

1.2 培養(yǎng)基

1）平板培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基，供活化菌種用.2）搖瓶菌種培養(yǎng)基：新鮮無病害馬鈴薯200.0g（取煮液），酵母浸膏5.0g，葡萄糖20.0g，加水至1 000mL，pH自然.3）發(fā)酵液體培養(yǎng)基：取干木瓜沸水煮30min，過濾得濾液，向濾液中加入相應(yīng)量的葡萄糖、黃豆粉和KH2PO4（詳見表1）.

1.3 儀器

KQ－500DB型超聲波清洗儀，艾朗旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國），ME215S型十萬分之一電子天平（德國Sartorios公司），25kg電子天平，高效液相色譜儀（DIONEX Ultimate 3000，美國戴安液相色譜有限公司），冷凍干燥機(jī)（FREEZ0NE PLUS 6，LABCONCO）.

1.4 試劑

齒孔酸（天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室提供），酵母浸膏和瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)有限公司），葡萄糖和KH2PO4為分析純.

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 液體培養(yǎng)基正交試驗設(shè)計

正交試驗優(yōu)選最佳搖瓶培養(yǎng)基：以每瓶菌絲體中齒孔酸的含量為評價指標(biāo)，采用正交試驗L9（34）對基本發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，從而篩選液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基，正交試驗因素水平見表1.

表1 培養(yǎng)基正交試驗因素水平（g／L）

2.2 培養(yǎng)方法

1）菌種活化：從母種試管中切出0.5cm2大小的菌絲塊接種于平板培養(yǎng)基的中部，培養(yǎng)5d后待用.

(3) 伴有癥狀的T波一過性高尖呈“帳篷狀T”或一過性倒置呈“冠狀T”，持續(xù)1 min；兩次發(fā)作間期≥1 min。

2）菌種液體培養(yǎng)：種子液的制備，取1cm2大小的活化菌種2～3塊接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（200mL培養(yǎng)基于500mL三角瓶），置于25℃旋轉(zhuǎn)式搖床上180 r／min振蕩培養(yǎng)5d；然后進(jìn)行液體培養(yǎng)，取長滿菌球的液體菌種，按5%的接種量接入各種試驗培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基平行做4瓶，靜置培養(yǎng)15d.

2.3 硫磺菌菌絲體中齒孔酸含量測定（RP－HPLC法）［6］

2.3.1 對照品溶液制備

精確稱取齒孔酸，用色譜級甲醇分別配成7.5，6.0，4.5，3.0，1.5mg／mL溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后作為對照品溶液.

2.3.2 樣品溶液制備

將硫磺菌菌絲體于50℃烘箱中烘干，取各組干燥菌絲體0.15g經(jīng)色譜級甲醇10mL 50℃超聲提取1h，0.22μm濾膜過濾后，用色譜級甲醇定容至10 mL作為待測樣品溶液.

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分析條件：色譜柱Diamonsil C18（250mm×4.6 mm.id.，5μm），柱溫25℃，流動相：乙腈10%～100%，超純水90%～0%，洗脫時間為30min；100%乙腈，10min；共計40min.檢測齒孔酸波長設(shè)定為203nm，進(jìn)樣10μL不同濃度的對照品溶液，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線：齒孔酸酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝19.07x＋3.378，r＝0.999 7.標(biāo)準(zhǔn)曲線在齒孔酸質(zhì)量濃度：7.5～1.5mg／mL之間時，線性較好（如圖1所示）.

2.3.4 樣品溶液的檢測

進(jìn)樣10μL樣品溶液，分析條件同標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制條件，樣品溶液高效液相分析圖譜如圖2所示.

圖1 對照品齒孔酸HPLC圖譜

圖2 硫磺菌菌絲體進(jìn)取提取物HPLC圖譜

2.3.5 穩(wěn)定性試驗［7］

取一樣品溶液，分別在0h，4h，8h，12h，16h，20 h，24h進(jìn)樣檢測方法的精確性，RSD＝2.47%，該方法24h內(nèi)穩(wěn)定性較好.

2.3.6 重復(fù)性實驗

取對照品10μL，重復(fù)5次進(jìn)樣，計算RSD，檢測方法的重復(fù)性，RSD＝1.46%，方法重復(fù)性良好.經(jīng)計算，各組干菌絲體和菌絲體中齒孔酸的含量見表2.

表3 齒孔酸含量極差分析

圖3 不同培養(yǎng)基對菌絲體中齒孔酸含量的影響

通過正交試驗，從9組試驗的菌絲體中齒孔酸的含量來看，組合2的菌絲體中齒孔酸的總量最高，總量為23.98mg.經(jīng)極差和直觀分析圖分析可知，較優(yōu)組合為A1B2C2D3，即在最佳液體培養(yǎng)基中，葡萄糖15g／L，黃豆粉1.5g／L，KH2PO42.0g／L，木瓜煎液（相當(dāng)于干）100g／L.從極差分析結(jié)果（表2）可以看出，RD＝9.73＞RA＝4.18＞RC＝4.06＞RB＝2.59，影響菌絲體中齒孔酸含量的因素分別為D＞A＞C＞B，說明在4個因素中，液體培養(yǎng)基中木瓜煎液濃度對菌絲體中齒孔酸的含量影響最大，其他3個因素依次是葡萄糖、K2HPO4、黃豆粉.

2.3.7 加樣回收試驗

精密稱取已知含量樣品5份，加入與樣品含量相當(dāng)?shù)膶φ掌罚瑴y定齒孔酸含量，計算回收率，結(jié)果見表4.

表4 齒孔酸加樣回收率（n＝5）

2.4 實驗重復(fù)性

將上述中A1B2C2D3培養(yǎng)基平行作4瓶，培養(yǎng)15d，稱取菌絲體干重和測定菌絲體中齒孔酸含量用以檢驗上述實驗的重復(fù)性，結(jié)果見表5.

表5 硫磺菌菌絲體中齒孔酸含量

表5中600mLA1B2C2D3培養(yǎng)基可產(chǎn)3.6g干菌絲體，單位菌絲體中齒孔酸含量為7.12mg／g，齒孔酸總含量為25.6mg，與表2中A1B2C2D3培養(yǎng)基比較無顯著差異，表明該條件可用于硫磺菌液體培養(yǎng).

3 討 論

硫磺菌是土家族人喜愛的山珍美味，其外形似展開的鷹翅膀，同時具有增強(qiáng)體質(zhì)的作用，故土家族人常稱之為鷹翅膀.硫磺菌具有很好的利用前景，但其自然資源少，人工培育成為規(guī)?；a(chǎn)供應(yīng)的重要途徑，但目前對硫磺菌功能性成分的制控研究較少，為更好控制硫磺菌質(zhì)量，為硫磺菌發(fā)酵培養(yǎng)和人工培育提供依據(jù)，本試驗選擇齒孔酸含量為指標(biāo)，對硫磺菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基條件進(jìn)行優(yōu)化.

前期篩選表明硫磺菌在加入木瓜的PDA培養(yǎng)基上生長速度明顯高于普通的PDA培養(yǎng)基；葡萄糖和黃豆粉是微生物液體培養(yǎng)基中常用的碳源和氮源；KH2PO4可提供磷元素與鉀元素；因此，選擇葡萄糖、黃豆粉、KH2PO4、木瓜進(jìn)行正交實驗.齒孔酸主要存在于硫磺菌菌絲體中，發(fā)酵液中含量極少，考慮到震蕩培養(yǎng)菌絲體很容易混入培養(yǎng)基中其他的物質(zhì)，影響定量，因此該實驗以靜置培養(yǎng)以便獲得盡可能干凈的菌絲體.實驗表明木瓜是影響菌絲體中齒孔酸含量的主要因素，可能與木瓜中富含齊敦果酸等三萜類成分影響齒孔酸的合成有關(guān)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究.

［1］ 盧東升，賈 曉，羅春芳.硫磺菌生物學(xué)特性研究［J］.中國食用菌，2009，28（5）：10－11.

［2］ 卯曉嵐.中國大型真菌［M］.鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2000：437.

［3］ Guan－Jhong Huang，Jeng－Shyan Deng.Hepatoprotective Effects of Eburicoic Acid and Dehydroeburicoi cacid from Antrodia Camphorata in a Mouse Model of Acute Hepatic Injury［J］.Food Chemistry，2013，141：3020－3027.

［4］ Wenjun Sun，Haibo He，Junzhi Wang.The Main Components Analysis of Laetiporussulphureu Crude Extract and Its Hepatoprotective Effect on Carbon Tetrachloride－induced Hepatic Fibrosis in Rats［J］.Applied Mechanics and Materials Vols，2014，（568－570）：1934－1939.

［5］ Francisco Leo＇n，Jose＇Quintana.Lanostanoid Triterpenes from Laetiporussulphureus and Apoptosis Induction on HL－60Human Myeloid Leukemia Cells［J］.J.Nat.Prod.，2004，67：2008－2011.

［6］ 周 俊，孫文軍，張 玲，等.忍冬木層孔菌總酚的HPLC分離及其指示性成分分析［J］.三峽大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2014，36（4）：110－112.

［7］ 王星琴，汪鋆植，郭志勇，等.大白栓菌中3－氫化松苓酸B含量的測定［J］.三峽大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，32（3）：94－99.