于晨陽(yáng)，毛縝

（中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(徐州)環(huán)境與測(cè)繪學(xué)院，江蘇 徐州 221116）

間甲酚作為我國(guó)優(yōu)先控制污染物甲酚的三種同分異構(gòu)體中的一種，毒性最大且最難降解，是有機(jī)化工中一種重要的原料，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于人類日常生活中，由于其具有強(qiáng)烈的毒性和腐蝕性且在環(huán)境中持久存在，已被美國(guó)EPA 列入環(huán)境優(yōu)先控制污染物的黑名單。我國(guó)地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定Ⅴ類水中揮發(fā)酚含量最高是1.0mg/L，同時(shí)在《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定間甲酚最高允許排放濃度不超過(guò)0.5mg/L。因此，有效去除間甲酚對(duì)保護(hù)環(huán)境和人類健康而言是刻不容緩的。

目前含酚廢水的生物降解法相對(duì)于其他物化處理方法，具有經(jīng)濟(jì)、安全、殘留少、無(wú)二次污染等方面的優(yōu)點(diǎn)，且在應(yīng)用方面更顯優(yōu)勢(shì)。但由于焦化、石化、制藥等行業(yè)排出的廢水中多元酚的濃度很 高[1]，其毒性會(huì)令很多微生物的生長(zhǎng)和降酚活性受到抑制，導(dǎo)致傳統(tǒng)的生物法在去除高濃度的間甲酚方面效率偏低，而高效菌投加技術(shù)可以很大地發(fā)揮微生物的潛力，能夠有效地解決難降解的問(wèn)題，所以分離高效降解菌株也受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者們的廣泛重視。付柳等[2]以間甲酚為基質(zhì)分離出復(fù)合菌種CDMs，當(dāng)間甲酚初始濃度為551mg/L 時(shí)，完全降解所需時(shí)間為65h，而600mg/L 的間甲酚在65h 內(nèi)降解率僅為2.67%。Jiang 等[3]通過(guò)對(duì)野生熱帶假絲酵母菌進(jìn)行氦氖激光輻射誘變獲得突變菌株CTM2，該菌株在5%的接種量下能降解300mg/L 的間甲酚，而在共基質(zhì)生物降解系統(tǒng)，0～500mg/L 濃度的苯酚能促進(jìn)CTM2 對(duì)間甲酚的降解，在苯酚以350mg/L 濃度存在時(shí)，300mg/L 的間甲酚能在46h被完全降解。Pichiah Saravanan 等[4]從污水處理廠分離出一個(gè)混合菌群，在27℃、150r/min、接種量為1%條件下，間甲酚初始濃度為300mg/L 時(shí)能夠達(dá)到最大降解速率，完全降解100mg/L 的間甲酚所需時(shí)間為14h，但當(dāng)初始濃度為900mg/L 時(shí)完全降解需要136h。由此可見(jiàn)，雖然國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)已有間甲酚降解菌株的報(bào)道，但是這些菌株耐受與降解的間甲酚濃度并不高。對(duì)于間甲酚生物降解代謝途徑方面的研究大致分為3 類：鄰位代謝途徑、間位代謝途徑和龍膽酸代謝途徑[5]。 鄰苯二酚是芳香烴類化合物降解的重要中間產(chǎn)物，因?yàn)閹缀跛械姆枷銦N類化合物都是先降解為鄰苯二酚，而后鄰苯二酚通過(guò)鄰位或間位雙加氧酶的作用進(jìn)行裂解使苯環(huán)斷裂。

本實(shí)驗(yàn)以焦化廠活性污泥作為原始菌源，旨在馴化篩選出一株以間甲酚為唯一碳源且具有高效降解能力的菌株，并對(duì)其降解特性以及降解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，以此為生物降解法提供高效降解菌菌源。同時(shí)，通過(guò)預(yù)測(cè)菌株降解間甲酚的趨勢(shì)來(lái)優(yōu)化生化處理的工藝條件，從而為提高菌株對(duì)間甲酚的降解效率方面提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

活性污泥取自圣戈班（中國(guó)）投資有限公司（原徐州鋼廠）焦化車間廢水處理站活性污泥。

馴化培養(yǎng)基由無(wú)機(jī)鹽溶液中添加一定濃度的間甲酚配制而成。各種無(wú)機(jī)鹽的含量為：KH2PO4，1.0g/L；K2HPO4，1.5g/L；MgSO4·7H2O，0.4g/L；CaCl2，0.01g/L；NaCl，0.6g/L；MnSO4·H2O，0.01g/L；FeCl3·6H2O，0.02g/L；NH4Cl，0.8g/L；間甲酚（200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L、1600mg/L、1800mg/L）。

1.2 菌種的馴化、篩選和分離

采用逐量分批馴化法進(jìn)行馴化，取5mL 原始菌源接入裝有50mL 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶中（其中間甲酚濃度為50mg/L），共接2 瓶。一瓶置于恒溫振蕩器中于30℃、150r/min 條件下培養(yǎng)，另一瓶置于4℃冰箱中不培養(yǎng)。經(jīng)48h 培養(yǎng)后，將培養(yǎng)與不培養(yǎng)的三角瓶同時(shí)取出，搖勻。若培養(yǎng)瓶中液體渾濁度高說(shuō)明已有菌增殖，則從培養(yǎng)瓶中取5mL 作為菌源接入50mL 間甲酚濃度為100mg/L 的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，重復(fù)上述培養(yǎng)與檢查。按照上面方法，不斷提高間甲酚在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的濃度，間甲酚的濃度分別為200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L、1600mg/L、1800mg/L，培養(yǎng)瓶中液體在間甲酚濃度為1800mg/L 不再變渾濁，所以取間甲酚濃度為1600mg/L 的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h 后的菌源進(jìn)行稀釋涂布和劃線，挑取不同的單菌落，將所得單菌落分別接入以1600mg/L 間甲酚為唯一碳源的50mL 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h后測(cè)定間甲酚剩余濃度，選取間甲酚降解率最大的菌株為馴化篩選得到的高效降解間甲酚菌株。

1.3 菌種鑒定

使用UNIQ-10 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒來(lái)提取菌株SMC 的基因組DNA。對(duì)提取的菌株基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增儀程序設(shè)定的擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：預(yù)變性94℃ 5min；循環(huán)94℃ 30s，55℃ 35s，72℃ 1min，35 個(gè)循環(huán)后于72℃再延伸8min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳后利用UNIQ-10 柱式DNA 膠回收試劑盒回收?；厥盏漠a(chǎn)物送到上海生物工程服務(wù)有限公司進(jìn)行16S rDNA序列的測(cè)定，并進(jìn)行序列Blast 比對(duì)分析，取其近緣菌的16S rDNA 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 分析方法

菌體濃度采用光密度法，即采用可見(jiàn)分光光度計(jì)，在600nm 波長(zhǎng)下測(cè)定菌懸液的吸光度（OD600）來(lái)代表間甲酚降解菌的濃度。吸光度值越高說(shuō)明培養(yǎng)基中的菌體質(zhì)量濃度越高。間甲酚濃度采用采用4-氨基安替比林法[6]。根據(jù)吸光度和間甲酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品間甲酚的濃度，從而計(jì)算樣品中間甲酚的降解效率。

1.5 間甲酚降解菌降解特性分析

分別考察溫度、pH 值、搖床轉(zhuǎn)速、氮源的種類對(duì)間甲酚降解率的影響，進(jìn)而確定菌株降解間甲酚的最適環(huán)境條件。測(cè)定菌株對(duì)間甲酚降解能力的試驗(yàn)在最適降解條件下進(jìn)行，取1%培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的菌株，接種到以不同間甲酚初始濃度為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定間甲酚殘余濃度。 1.6 間甲酚的降解動(dòng)力學(xué)

由于間甲酚為有毒化合物，高濃度間甲酚的存在會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，目前的研究中，很多學(xué)者[7-10]都采用Haldane 模型來(lái)描述間甲酚為底物時(shí)菌體的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。在本實(shí)驗(yàn)中也觀察到了明顯的底物抑制作用，故也選擇Haldane 模型來(lái)模擬在以間甲酚為唯一碳源時(shí)菌株的降解動(dòng)力學(xué)行為。方程式為式（1）。

式中，μmax為細(xì)胞最大比生長(zhǎng)速率，h-1；μχ為菌體的比生長(zhǎng)速率，h-1；Ks為菌體生長(zhǎng)半飽和系數(shù)，mg/L；S 為底物的濃度，mg/L；Ki為底物抑制系數(shù)，mg/L。利用MATLAB 軟件對(duì)μ 和S 作非線性最小二乘回歸分析，從而得到μmax、Ks和 Ki的值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的分離與鑒定

用以間甲酚為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行菌種的馴化，培養(yǎng)48h 后，在間甲酚濃度為1600mg/L的培養(yǎng)基上篩選出一株降解率達(dá)到97.8%的高降解率的菌株，將其命名為SMC。

該菌在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上30℃恒溫培養(yǎng)24h 后的菌落為淺黃色的圓形菌落，直徑達(dá)2.5～5mm，表面凸起有光澤，邊緣光滑，再培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察到邊緣變粗糙。通過(guò)革蘭氏染色后觀察該菌顏色呈紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌。菌株SMC基因組DNA 經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增后產(chǎn)物的電泳圖譜如圖1 所示。根據(jù)菌株SMC 測(cè)定的16S rDNA 序列與Genebank 中已報(bào)道的16S rDNA 序列進(jìn)行同源性比較，利用MEGA 軟件構(gòu)建Neighbour-Joining 樹(shù)，結(jié)果表明菌株SMC 的16S rDNA 序列與在Genebank登記Bacillus cereus（蠟樣芽孢桿菌）同源性相似度達(dá)到99.7%，初步證明菌株SMC 為Bacillus 屬。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。

目前，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者在篩選間甲酚高效降解菌方面也做了大量工作，已篩選出多種間甲酚降解微生物。包括姜巖等[3]發(fā)現(xiàn)的熱帶假絲酵母菌、宋正光等[8]報(bào)道的麥芽糖假絲酵母菌、白靜[9]報(bào)道的糞產(chǎn)堿桿菌、彭麗花等[11]報(bào)道的Citrobacter farmeri、吳坤等[12]報(bào)道的雜色云芝（Coriolus versicolor），但關(guān)于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）菌株降解間甲酚的報(bào)道還沒(méi)有。本文作者在對(duì)與間甲酚結(jié)構(gòu)具有較高相似性的苯酚的降解研究中卻發(fā)現(xiàn)有不少學(xué)者分離出芽孢桿菌屬的菌株，如Arutchelvan 等[13]分離到的Bacillus brevis 菌株、袁利娟等[14]分離到的Bacillus sp. JY01、李淑彬等[15]分離到的Jp-A 和于彩虹等[16]篩選出的B3 與本實(shí)驗(yàn)菌株SMC 同屬于蠟狀芽孢桿菌（ Bacillus cereus），由此推測(cè)芽孢桿菌屬菌株同樣適用于苯酚的降解。有研究表明，該菌也能以甲苯、氯酚類和硝基酚類等芳香烴類物質(zhì)作為唯一碳源生長(zhǎng)[15]。同一微生物體可以降解多種芳烴可使該微生物具有適應(yīng)復(fù)雜的污染環(huán)境的優(yōu)勢(shì)，因此對(duì)于成分復(fù)雜的含酚工業(yè)廢水，高效廣譜的降解菌的篩選在含酚工業(yè)廢水的處理方面十分重要，而這正可以體現(xiàn)出芽孢桿菌屬的SMC 菌株降解含酚工業(yè)廢水的優(yōu)越性。

圖1 菌株SMC PCR 產(chǎn)物電泳圖譜

圖2 菌株SMC Neighbour-Joining 樹(shù)

2.2 環(huán)境因素對(duì)間甲酚降解的影響

2.2.1 溫度對(duì)菌株SMC 降解間甲酚的影響

將菌株SMC 在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以1%接種量接種到以1600mg/L 間甲酚為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在不同溫度下（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、150r/min 氣浴恒溫振蕩中培養(yǎng)24h 后測(cè)定間甲酚殘留濃度。

由圖3 可以看出，在20～35℃范圍內(nèi)，間甲酚的降解率都在90%以上，說(shuō)明菌種都能有效地降解間甲酚，其中30℃時(shí)菌種降解率最高。在小于20℃或大于35℃時(shí)，菌株SMC 對(duì)間甲酚的降解效果明顯的降低，這是由于超出適宜的溫度都會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)。低溫會(huì)降低微生物的代謝活性，而過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致代謝過(guò)程中所需的酶失活或變性，以致無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)間甲酚的代謝。故本實(shí)驗(yàn)中菌種最適溫度為30℃。

2.2.2 pH 值對(duì)菌株SMC 降解間甲酚的影響

分別調(diào)節(jié)以1600mg/L 間甲酚為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH 值為3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11，將菌株SMC 在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以1%接種量接種，30℃、150r/min 氣浴恒溫振 蕩中培養(yǎng)24h 后，測(cè)定間甲酚殘留濃度。

圖3 溫度對(duì)間甲酚降解率的影響

結(jié)果如圖4 所示，當(dāng)pH 值在6～7.5 之間，間甲酚降解率隨pH 值升高而不斷增大；pH 值在7.5～9 之間時(shí)，降解率變化緩慢，基本保持平穩(wěn)，但降解率均達(dá)到90%以上，pH 值為7.5 時(shí)降解效果最好；當(dāng)pH 值大于9 以后，間甲酚降解率呈迅速下降之勢(shì)。培養(yǎng)基以NH4Cl 作為氮源，在菌種對(duì)氮源需求下，細(xì)胞會(huì)吸收離子NH4+，使得無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中pH 值會(huì)下降，所以隨著培養(yǎng)基初始pH 值逐漸升高，酸性得到中和而減弱對(duì)降酚作用的影響。但當(dāng)培養(yǎng)基過(guò)于偏堿時(shí)，菌株仍會(huì)受到堿性侵害，影響正常的生理活動(dòng)，從而導(dǎo)致降解率下降。故本實(shí)驗(yàn)中菌種采用最適pH 值為7.5。

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株SMC 降解間甲酚的影響

將菌株SMC 在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以1%接種量接種到以1600mg/L 間甲酚為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30℃、不同搖床轉(zhuǎn)速下（0r/min、50r/min、100r/min、150r/min、200r/min）氣浴恒溫振蕩中培養(yǎng)24h 后，測(cè)定間甲酚殘留濃度。

結(jié)果如圖5 所示，搖床轉(zhuǎn)速可在某種程度上反映菌種對(duì)溶解氧的需求[11]，提高搖床的轉(zhuǎn)速可以提高菌株SMC 的間甲酚降解率。這可能是由于轉(zhuǎn)速的加快提高了菌體同間甲酚的接觸面積和氧氣傳遞速率，但是達(dá)到150r/min 以上時(shí)，對(duì)降酚率的影響不大，但當(dāng)轉(zhuǎn)速大于200r/min 有可能會(huì)影響細(xì)菌對(duì)底物在降解前的吸附從而降低降解效率[11]?？紤]動(dòng)力的因素，本實(shí)驗(yàn)搖床最佳轉(zhuǎn)速確定為150r/min。

圖4 pH 值對(duì)間甲酚降解率的影響

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)間甲酚降解率的影響

2.2.4 不同間甲酚初始濃度對(duì)菌株SMC 降解能力的影響

將菌株SMC 在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以1%接種量接種到以不同初始濃度間甲酚為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在最佳培養(yǎng)條件下，30℃、150r/min 氣浴恒溫振蕩中培養(yǎng)，定時(shí)取樣，測(cè)定間甲酚剩余濃度，繪制間甲酚降解曲線。

結(jié)果如圖6 所示，初始濃度為1000mg/L、1200mg/L、1400mg/L、1600mg/L、1800mg/L 的間甲酚，降解率達(dá)95%所需時(shí)間分別為16h、24h、32h、46h、70h。而且菌株SMC 在48h 內(nèi)對(duì)初始濃度為1600mg/L 的間甲酚降解率達(dá)到97.81%，初始濃度為1800mg/L 的間甲酚經(jīng)過(guò)菌株72h 的降解，降解率能達(dá)到98.06%。但初始濃度為1900mg/L 時(shí)，培養(yǎng)基中菌濃度逐漸減少，而且降解效果在72h 后依然不明顯，降解率僅為5%左右。因此認(rèn)為菌株SMC對(duì)間甲酚最大耐受能力為1900mg/L。查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)目前發(fā)表的間甲酚降解菌株的間甲酚耐受濃度沒(méi)有本實(shí)驗(yàn)獲得的菌株SMC 高，且降解間甲酚的性能也沒(méi)有菌株SMC 好[2，3，12-13，17]。由此可以看出，SMC 具有很強(qiáng)的降解間甲酚的能力，是一株間甲酚高效降解菌。

2.3 間甲酚降解動(dòng)力學(xué)方程

圖6 菌株SMC 不同間甲酚初始濃度的降解曲線

圖7 不同間甲酚初始濃度對(duì)菌株比生長(zhǎng)率的影響

通過(guò)MATLAB 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)值進(jìn)行非線性最小二乘回歸，得到 Haldane 方程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：μmax=0.01252h-1，KS=34.58mg/L，Ki=479.5mg/L，相關(guān)系數(shù)R2=0.932。擬合曲線和實(shí)驗(yàn)值的對(duì)比見(jiàn)圖7。從圖7 可以看出，理論值和實(shí)驗(yàn)值擬和較好，菌體 的比生長(zhǎng)速率隨著底物濃度的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，所得的動(dòng)力學(xué)方程也能較好地描述實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)趨勢(shì)。有研究證明，Ks值較低而Ki較高的菌株，其耐受性和降解能力都會(huì)更好[18]。本研究中的菌株SMC 的Ks值比之前報(bào)道的菌株更低，而且Ki值更高[7-10]。這和前面得出的該菌種有著高的降解性和耐受力的結(jié)論顯然是符合的，而且這種耐受特性正是由該菌種的遺傳特性所決定。

3 結(jié) 論

（1）從某焦化廠活性污泥中分離到一株能利用間甲酚作為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株SMC，屬革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)其16SrDNA 序列進(jìn)行分析，初步確定為Bacillus cereus（蠟樣芽孢桿菌）。

（2）SMC 降解間甲酚的最佳條件：溫度為30℃，pH 值為7.5，轉(zhuǎn)速為150r/min。在最佳降解條件下，該菌株在48h 內(nèi)對(duì)濃度1600mg/L 的間甲酚降解率達(dá)97.81%，72h 內(nèi)對(duì)濃度為1800mg/L 的間甲酚降解率達(dá)98.06%，得到菌株SMC 對(duì)間甲酚的最大耐受能力為1900mg/L。

（3）按照Haldane 模型進(jìn)行非線性最小二乘曲線擬合，得到菌株SMC 降解間甲酚的動(dòng)力學(xué)參數(shù)為μmax=0.01252h-1，KS=34.58mg/L，Ki=479.5mg/L，由擬合曲線的趨勢(shì)再次證明菌株SMC 對(duì)高濃度間甲酚具有較高的耐受性和較好的降解能力。因此，該菌株有可能成為工業(yè)含酚廢水生物降解法的強(qiáng)化菌株，有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的價(jià)值。

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