王重喜,羅學(xué)剛,李朋彥,陳小穎,周 浩,張同存,
(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;2. 武漢科技大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院,武漢 430000)
一種基于熒光檢測(cè)的GST-pull down改進(jìn)方法的建立及對(duì)Atsttrin-TNFR2相互作用的分析
王重喜1,羅學(xué)剛1,李朋彥1,陳小穎1,周 浩1,張同存1,2
(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;2. 武漢科技大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院,武漢 430000)
創(chuàng)建一種基于熒光檢測(cè)的GST-pull down改進(jìn)方法,用于蛋白質(zhì)間相互作用分析.利用已確定具有相互作用的Atsttrin和TNFR2蛋白對(duì)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分別構(gòu)建GST-Atsttrin和TNFR2-EYFP融合蛋白的原核和真核表達(dá)體系.將純化的GST-Atsttrin與TNFR2-EYFP蛋白孵育后,經(jīng)離心收集復(fù)合物,通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光值,從而分析Atsttrin和TNFR2間的相互作用.通過(guò)熒光值的檢測(cè)成功分析了Atsttrin和TNFR2間的相互作用,熒光值的檢測(cè)可代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法中的Western blot分析,從而簡(jiǎn)化GST-pull down分析步驟、降低操作難度、并可對(duì)缺乏特異性抗體的靶蛋白進(jìn)行有效地分析.
蛋白質(zhì)相互作用;熒光檢測(cè);GST-pull down
EYFP作為EGFP蛋白的改進(jìn)型,可在500,nm的激發(fā)光激發(fā)下產(chǎn)生528,nm的發(fā)射光,因其易于檢測(cè),熒光強(qiáng)、發(fā)光穩(wěn)定、沒(méi)有細(xì)胞種類(lèi)和位置上的限制且載體易于構(gòu)建,在生物大分子標(biāo)記和蛋白間相互作用中都有重要應(yīng)用[6-7].實(shí)驗(yàn)示意圖如圖1所示.
圖1 基于熒光檢測(cè)的GST-pull down方法示意圖Fig. 1 Schema of the GST-pull down based on fluorescence detection
本實(shí)驗(yàn)選用已確定能發(fā)生相互作用的蛋白對(duì)Atsttrin和腫瘤壞死因子受體2(Tumor necrosis factor receptor 2,TNFR2)[8-9]作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分別構(gòu)建GSTAtsttrin原核表達(dá)載體和TNFR2-EYFP真核表達(dá)載體,并在大腸桿菌及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá).將原核表達(dá)的GST-Atsttrin融合蛋白親和固定到GST樹(shù)脂上,再向其中加入含有TNFR2-EYFP融合蛋白的細(xì)胞裂解液.因Atsttrin和TNFR2間的相互作用而形成樹(shù)脂-GST-Atsttrin-TNFR2-EYFP復(fù)合物,在GST樹(shù)脂的重力作用下瞬時(shí)離心可以得到該復(fù)合物.最后利用EYFP的熒光特性,在多功能酶標(biāo)儀上用500,nm的激發(fā)光激發(fā),檢測(cè)528,nm發(fā)射光的熒光值,即可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)間相互作用的分析.
1.1 材料
1.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及菌株
人正常乳腺細(xì)胞(HBL100)、非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞(COS-7)、質(zhì)粒pGEX-6p-3及pEYFP-N1均為本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒pMD18T-Atsttrin為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建;大腸桿菌(Escherichia coli)JM109和BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存.
1.1.2 主要試劑
Pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶,TaKaRa公司;核酸Marker、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,北京康為世紀(jì)公司;High-Affinity GST Resin,南京金斯瑞生物科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒和IPTG,北京索萊寶公司;細(xì)胞培養(yǎng)基,Gibco公司;細(xì)胞胎牛血清,杭州四季青公司;核酸限制性?xún)?nèi)切酶、蛋白Marker、TuroFect細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑,F(xiàn)ermentas公司;實(shí)驗(yàn)所用其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?引物合成及序列測(cè)序由北京英濰捷基公司完成.
1.2 方法
1.2.1 質(zhì)粒pEYFP-TNFR2構(gòu)建及鑒定
根據(jù)Uniprot提供的TNFR2胞外域蛋白序列(P20333)和NCBI提供的TNFR2基因序列(Gene ID:7133),克隆其胞外域23到257位部分.利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增TNFR2,酶切位點(diǎn)用下劃線表示,P1:5'-TAGGAATTC GCCACCATGTTGC CCGCCCAGGTG-3'(EcoRⅠ),P2:5'-GGAGGATCC GAGTCGCCAGTGCTCCCTTCAG-3'(BamHⅠ).實(shí)驗(yàn)中選用人正常乳腺細(xì)胞(HBL100)的cDNA作為模板,擴(kuò)增目的基因TNFR2.將PCR產(chǎn)物和載體pEYFP-N1分別雙酶切,切膠回收,經(jīng)T4,DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞.經(jīng)卡那霉素抗性篩選,挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR及雙酶切驗(yàn)證,驗(yàn)證正確后經(jīng)測(cè)序鑒定.
1.2.2 質(zhì)粒pGEX-Atsttrin構(gòu)建及鑒定
以pMD18T-Atsttrin為模板,通過(guò)PCR方法擴(kuò)增Atsttrin基因.所用引物為P3:5'-TCGGGATCC GAAAA TCTGTATTTTCAGGGCCCGCAGGCTTCCTGCTGT G-3'(BamHⅠ),P4:5'-CCGCTCGAGTTATGGGATT GGACAGCAGC-3'(XhoⅠ).為方便在今后的引物中切割去除GST標(biāo)簽,在上游引物中引入TEV蛋白酶的切割位點(diǎn)(斜體部分).將PCR產(chǎn)物和pGEX-6p-3載體分別雙酶切,切膠回收,連接轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞.經(jīng)氨芐青霉素(Amp)抗性篩選后,利用菌落PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆.
1.2.3 GST-Atsttrin融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和優(yōu)化
燒傷在臨床上較為多見(jiàn),一般小面積的Ⅰ度燒傷多半能自愈,但是如果燒傷面積在Ⅱ、Ⅲ度燒傷,易導(dǎo)致創(chuàng)面出現(xiàn)感染,延長(zhǎng)患者的住院時(shí)間,因此,創(chuàng)面的處理好壞與燒傷后的感染、病程、功能恢復(fù)都有著密切的聯(lián)系,直接影響病情的發(fā)展。因此,對(duì)于燒傷患者正確的創(chuàng)面處理,合理的外用藥物選擇都將是燒傷患者治愈的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。對(duì)此,本次研究就選取了我院96例(2015年11月-2017年5月)燒傷患者,分別選用了1%磺胺嘧啶銀霜和磺胺嘧啶銀鋅霜兩種藥物進(jìn)行治療,分析以上兩種藥物對(duì)燒傷患者的臨床治療效果的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。
重組質(zhì)粒pGEX-Atsttrin轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3),將轉(zhuǎn)化后的重組表達(dá)菌株接種于含Amp(100,μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中,37,℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后以2%接種量接種于50,mL含Amp(100,μg/mL)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中(250,mL搖瓶),于37,℃培養(yǎng)至A600為0.6~0.8時(shí)(約2,h),加入終濃度為1.0,mmol/L的IPTG,30,℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4,h.同時(shí)以空質(zhì)粒pGEX-6P-3轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)誘導(dǎo)培養(yǎng)作為陰性對(duì)照.
誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化:在30,℃條件下,加入終濃度為1.0,mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng),分別誘導(dǎo)1、2、4、6、8,h后取樣用于SDS-PAGE分析.
誘導(dǎo)劑濃度優(yōu)化:分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,mmol/L的IPTG,30,℃誘導(dǎo)培養(yǎng),用SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)情況.
1.2.4 GST-Atsttrin融合蛋白純化
誘導(dǎo)完畢,4,℃離心收集菌體,用PBS洗滌3次.每100,mg濕菌體加3.3,mL PBS將菌體重懸并超聲破碎,4,℃、12,000,r/min離心30,min收集上清液,并用0.45,μm濾膜過(guò)濾.用4,℃預(yù)冷的PBS平衡GST樹(shù)脂后,將上清液蛋白上柱純化.再次用4,℃預(yù)冷的PBS洗滌雜蛋白后,取少量與GST-Atsttrin融合蛋白結(jié)合的GST樹(shù)脂用于SDS-PAGE分析,其余4,℃儲(chǔ)存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).
1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及TNFR2-EYFP融合蛋白的制備
按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作,將質(zhì)粒pEYFP-TNFR2轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞.培養(yǎng)24,h后,棄培養(yǎng)基,用PBS洗滌細(xì)胞兩次,加入1.0,mL細(xì)胞裂解液(4,℃預(yù)冷),置于冰上裂解30,min后,13,000,r/min離心10,min收集上清液蛋白.
1.2.6 GST-Atstttrin和TNFR2-EYFP相互作用
將50,μL 1.2.4節(jié)所得GST樹(shù)脂加入到500,μL 1.2.5節(jié)所得上清液蛋白中,置于旋轉(zhuǎn)搖床,4,℃孵育12,h.800,r/min短暫離心20,s后棄上清液蛋白,用1,mL NETN細(xì)胞裂解液(4,℃預(yù)冷)重復(fù)洗滌3次,用200,μL PBS吹懸樹(shù)脂.將所得樹(shù)脂加入到96孔熒光檢測(cè)板中,在多功能酶標(biāo)儀(Bioteck)上用500,nm的激發(fā)光激發(fā),檢測(cè)528,nm發(fā)射光的熒光值.
2.1 重組質(zhì)粒pEYFP-TNFR2和pGEX-Atsttrin的構(gòu)建及鑒定
以HBL100細(xì)胞的cDNA為模板,用引物P1和P2擴(kuò)增TNFR2基因,并定向克隆到載體EcoRⅠ和BamHⅠ之間.PCR后可擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的目的條帶,且重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可檢測(cè)到目的條帶(圖2(a)).另一方面,以pMD18T-Atsttrin為模板,用引物P3和P4擴(kuò)增Atsttrin基因并亞克隆到pGEX-6P-3質(zhì)粒中.重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后可檢測(cè)到與預(yù)期大小相符的目的條帶(圖2(b)).進(jìn)一步通過(guò)測(cè)序證實(shí),重組質(zhì)粒pEYFP-TNFR2和pGEXAtsttrin均構(gòu)建成功.
圖2 質(zhì)粒構(gòu)建Fig. 2 The construction of recombinant vectors
2.2 GST-Atsttrin融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
質(zhì)粒pGEX-6p-3和pGEX-Atsttrin分別轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),GST-Atsttrin融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析如圖3所示.重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在相對(duì)分子質(zhì)量4.3×104處可見(jiàn)GST-Atsttrin融合蛋白條帶(GST蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約2.6×104,Atsttrin蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約1.7× 104).進(jìn)一步對(duì)菌體超聲破碎后所獲得的上清和沉淀進(jìn)行電泳分析,結(jié)果顯示目的蛋白可溶率達(dá)90%.
圖3 GST-Atsttrin融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the expression and solubility of GST-Atsttrin fusion protein
為進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,首先將重組菌株E. coli BL21(DE3)/pGEX-Atsttrin以1.0,mmol/L的IPTG 30,℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8,h,每2,h取樣分析.SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示重組蛋白的可溶性表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加,誘導(dǎo)6,h時(shí)融合蛋白有最大的表達(dá)量(圖4(a)).進(jìn)而分別在30,℃以終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,mmol/L的IPTG條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6,h,結(jié)果表明0.6,mmol/L的IPTG對(duì)菌體誘導(dǎo)效果最好(圖4(b)).對(duì)優(yōu)化后融合蛋白的可溶性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示目的蛋白依然具有很好的可溶性(圖5).因而確定GST-Atsttrin融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最優(yōu)條件為30,℃,以0.6,mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6,h. Quantity one軟件分析顯示可溶性融合蛋白的量可占菌體總蛋白的30%以上.
圖4 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間及IPTG濃度的優(yōu)化Fig. 4Optimization of the induction time and concentration of IPTG
圖5 優(yōu)化后蛋白可溶性分析Fig. 5Analysis of the solubility of GST-Atsttrin fusion protein
2.3 GST-Atsttrin融合蛋白的純化
將誘導(dǎo)菌體超聲破碎后,離心取上清于GST親和層析柱純化融合蛋白.SDS-PAGE分析結(jié)果顯示:通過(guò)一次親和層析可除去絕大多數(shù)的雜蛋白,但在相對(duì)分子質(zhì)量為2.8×104的附近依然存在一條雜蛋白帶,其位置與空質(zhì)粒pGEX-6P-3誘導(dǎo)表達(dá)的GST產(chǎn)物相同(圖6,圖3(a)).由此表明重組菌株E. coli BL21(DE3)/pGEX-Atsttrin在表達(dá)融合蛋白的同時(shí),也會(huì)產(chǎn)生一定的GST單獨(dú)表達(dá)產(chǎn)物.這很可能是由于人源基因Atsttrin密碼子與E. coli偏愛(ài)性間所存在的差異造成翻譯出現(xiàn)中斷或外源基因mRNA不穩(wěn)定發(fā)生斷裂而造成的.
圖6 GST-Atsttrin融合蛋白的純化Fig. 6 Purification of the GST-Atsttrin fusion protein
2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及TNFR2-EYFP融合蛋白的熒光檢測(cè)
將質(zhì)粒pEYFP-TNFR2轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,培養(yǎng)24,h后,通過(guò)熒光顯微鏡分析TNFR2-EYFP目的蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果如圖7所示.
圖7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEYFP-TNFR2質(zhì)粒后熒光圖片F(xiàn)ig. 7 Micrographs of cells transfected with pEYFPTNFR2 vector
轉(zhuǎn)染細(xì)胞可觀測(cè)到明顯的熒光,表明融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)可獲得很好地表達(dá).進(jìn)一步收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,裂解收取上清獲得TNFR2-EYFP樣品,利用多功能酶標(biāo)儀對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行定量分析,結(jié)果如圖8所示.結(jié)果顯示細(xì)胞裂解液試劑對(duì)熒光值的測(cè)定沒(méi)有影響;同時(shí),熒光值與融合蛋白TNFR2-EYFP樣品間具有良好的劑量依賴(lài)關(guān)系,表明熒光值的強(qiáng)弱可以很好地反映出EYFP融合蛋白的含量高低.
圖8 TNFR2-EYFP融合蛋白的熒光值與其劑量間的關(guān)系Fig. 8Relationship between the fluorescence of TNFR2-EYFP fusion protein and its amount
2.5 Atsttrin和TNFR2相互作用分析
為驗(yàn)證熒光測(cè)定方法是否可很好地用于蛋白質(zhì)間相互作用的GST-pull down分析,首先對(duì)GST-pull down系統(tǒng)所涉及到的COS-7細(xì)胞及E. coli內(nèi)源性雜蛋白、GST標(biāo)簽蛋白及樹(shù)脂對(duì)EYFP熒光測(cè)定是否會(huì)產(chǎn)生干擾進(jìn)行了分析.與對(duì)照組相比上述“雜質(zhì)”均不會(huì)對(duì)EYFP熒光值的測(cè)定產(chǎn)生顯著性的影響(圖9(a)).在此基礎(chǔ)上,分別將Atsttrin-GST-樹(shù)脂復(fù)合物、GST-樹(shù)脂復(fù)合物與轉(zhuǎn)染pEYFP-TNFR2的細(xì)胞裂解液共同孵育,短暫離心并用PBS清洗GST樹(shù)脂后,于多功能酶標(biāo)儀中測(cè)定EYFP的熒光值.與GST-樹(shù)脂復(fù)合物相比,Atsttrin-GST-樹(shù)脂復(fù)合物在與pEYFP-TNFR2細(xì)胞裂解液孵育后,可檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)(圖9(b)),表明Atsttrin-GST-樹(shù)脂復(fù)合物可將TNFR2-EYFP從細(xì)胞裂解液中捕獲富集出來(lái),且熒光檢測(cè)法能夠很好地檢測(cè)這一過(guò)程.改進(jìn)后的方法可很好地用于蛋白質(zhì)間相互作用的分析.
圖9 Atsttrin和TNFR2相互作用分析Fig. 9 Interaction analysis of Atsttrin and TNFR2
相比酵母雙雜交、Co-IP、FRET等方法,GST-pull down簡(jiǎn)便易行、實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好,因此在蛋白質(zhì)相互作用分析方面得到了廣泛的應(yīng)用.本研究在傳統(tǒng)GST-pull down方法基礎(chǔ)上,對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn).通過(guò)將靶蛋白與EYFP融合表達(dá),以EYFP熒光值的檢測(cè)代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法中的SDS-PAGE及Western blot分析,從而大大簡(jiǎn)化了GST-pull down分析步驟、降低了操作難度、并可對(duì)缺乏特異性抗體的靶蛋白進(jìn)行有效的分析.本研究結(jié)果顯示EYFP的熒光值與EYFP融合蛋白的含量間具有良好的劑量依賴(lài)關(guān)系,且整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系中可能存在的真核細(xì)胞及E. coli的內(nèi)源性物質(zhì)、GST蛋白、親和樹(shù)脂、細(xì)胞裂解液等“雜質(zhì)”均不會(huì)對(duì)EYFP熒光測(cè)定產(chǎn)生顯著性影響,因此本方法可很好地通過(guò)檢測(cè)EYFP熒光值的大小實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)間相互作用的分析.
正確空間結(jié)構(gòu)的形成對(duì)于蛋白質(zhì)相互作用的體外分析十分重要[4].GST是E. coli天然高效、可溶性表達(dá)的蛋白質(zhì),在作為融合表達(dá)標(biāo)簽時(shí)可促進(jìn)目的蛋白質(zhì)二硫鍵的形成,從而使表達(dá)產(chǎn)物折疊形成正確的空間結(jié)構(gòu)[5,10].此外,GST還有利于增強(qiáng)融合蛋白的翻譯效率及穩(wěn)定性,從而大大提高表達(dá)水平[11].在本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化,在30,℃、IPTG濃度為0.6,mmol/L時(shí)誘導(dǎo)培養(yǎng)6,h,可確保GST-Atsttrin融合蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大(250,mg/mL),同時(shí)可溶性蛋白比率可高達(dá)90%以上,確保了相互作用分析的正確性.
在本實(shí)驗(yàn)中選用的研究對(duì)象Atsttrin是新近報(bào)道的TNFR2特異性拮抗蛋白[8-9].TNFα 作為促炎因子,在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthrits,RA)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎(psoriasis arthritsi,PA)、強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)等免疫系統(tǒng)疾病過(guò)程中起著重要作用[12-13].相比于TNFR1,TNFR2相對(duì)有限的細(xì)胞分布,使得TNFR2成為更為特異、安全的治療靶點(diǎn)[14-15].Atsttrin可與TNFα 競(jìng)爭(zhēng)對(duì)TNFR2的結(jié)合,從而有效發(fā)揮對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的高效抑制作用[8-9].不僅如此,藥物動(dòng)力學(xué)分析表明Atsttrin在體內(nèi)具有較為理想的消除半衰期和生物利用度,表明Atsttrin及其衍生物將是有潛力的抗關(guān)節(jié)炎新藥[8-9].本文改進(jìn)后的GST-pull down方法可為Atsttrin蛋白質(zhì)序列的進(jìn)一步優(yōu)化以及新型抗關(guān)節(jié)炎新藥的篩選提供一種新的有力手段.此外,在質(zhì)粒構(gòu)建時(shí),還在GST與Atsttrin之間添加了TEV蛋白酶的切割位點(diǎn),后續(xù)亦可通過(guò)TEV酶切釋放Atsttrin,用于該蛋白質(zhì)的制備生產(chǎn).
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責(zé)任編輯:周建軍
An Improved Method of GST-pull Down Based on Fluorescence Detection and its Application to the Analysis of the Interaction between Atsttrin and TNFR2
WANG Chongxi1,LUO Xuegang1,LI Pengyan1,CHEN Xiaoying1,ZHOU Hao1,ZHANG Tongcun1,2
(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China;2. Institute of Biology and Medicine,Wuhan University of Science and Technology,Wuhan 430000,China)
An improved method of GST-pull down based on fluorescence detection was developed and could be applied to analyzing protein interaction. Based on the confirmed interaction between TNFR2 and Atsttrin,recombinant expression vectors pGEX-Atsttrin and pEYFP-TNFR2 were constructed. GST-Atsttrin fusion proteins were purified by affinity chromatography,and then incubated with TNFR2-EYFP fusion proteins. After centrifugation,the complex was collected,and the interaction between Atsttrin and TNFR2-EYFP was analyzed through measuring the fluorescence intensity with multifunctional microplate reader. The interaction between Atsttrin and TNFR2 was verified by the detection of the fluorescence after the GST-pull down. Compared with the traditional method,the new method was more convenient and could be used to analyze the target protein without specific antibodies.
protein interaction;fluorescence detection;GST-pull down
Q71 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1672-6510(2015)01-0034-07
10.13364/j.issn.1672-6510.20140062
蛋白質(zhì)間的相互作用在生物細(xì)胞的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用,研究蛋白質(zhì)間的相互作用,對(duì)于蛋白質(zhì)功能的分析、疾病機(jī)理的闡明和新藥的研發(fā)具有十分重要的意義[1-2].目前常用的研究蛋白質(zhì)間相互作用的方法主要有酵母雙雜交、GST-pull down、免疫共沉淀(Co-IP)和熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)等[3].其中,GST-pull down技術(shù)是利用谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)與谷胱甘肽間的特異性結(jié)合,研究蛋白質(zhì)體外直接相互作用的重要手段[2,4].其基本原理[3,5]是將目的蛋白與GST標(biāo)簽融合表達(dá),將得到的融合蛋白親和固定到谷胱甘肽樹(shù)脂上當(dāng)作“誘餌蛋白”,加入另一種蛋白溶液后,由于蛋白質(zhì)間的相互作用,可從中捕獲出能與目的蛋白相互作用的“靶蛋白”,而形成GST-誘餌蛋白-靶蛋白的復(fù)合物.收集復(fù)合物后通過(guò)SDS-PAGE或Western blot檢測(cè)靶蛋白的存在,從而分析證實(shí)目的蛋白和靶蛋白間的相互作用.然而,SDS-PAGE分析對(duì)靶蛋白的測(cè)定特異性較低,而Western blot檢測(cè)則步驟繁瑣、操作難度較大、成本較高,而且無(wú)法適用于缺乏特異性抗體的靶蛋白(如新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)或免疫原性較弱的蛋白質(zhì))的分析,因此該方法需進(jìn)一步改良.
2014-04-19;
2014-06-25
國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)資助項(xiàng)目(2012AA021505);教育部“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”資助項(xiàng)目(IRT1166)
王重喜(1989—),男,碩士研究生;通信作者:羅學(xué)剛,副教授,luoxuegang@hotmail.com.