耿曉玲，蔡　莉，王均華，王　朋（.江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)紡織工程系，江蘇江陰443；.江陰市食品安全檢測中心，江蘇江陰443）

L-鳥氨酸發(fā)酵廢菌渣水解固形物回用工藝的研究

耿曉玲1，蔡莉1，王均華2，王朋1
（1.江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)紡織工程系，江蘇江陰214431；2.江陰市食品安全檢測中心，江蘇江陰214431）

摘要：以L-鳥氨酸發(fā)酵廢菌渣水解固形物為有機(jī)氮源，進(jìn)行L-鳥氨酸發(fā)酵工藝條件的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)最佳回用工藝條件為：水解時(shí)間20 h，水解溫度90.0℃，水解液加入量6.5 g/100 mL，6.0 mol/L硫酸溶液（mL）與含水廢菌渣固形物（g）之比1∶2.5。在上述條件下，L-鳥氨酸產(chǎn)量達(dá)到了37.47 g/L，與酵母膏為有機(jī)氮源進(jìn)行的鳥氨酸發(fā)酵差異不明顯，且產(chǎn)量穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：L-鳥氨酸；廢菌渣；正交試驗(yàn)；工藝條件

L-鳥氨酸作為一種醫(yī)藥、保健品以及化工產(chǎn)品的原料應(yīng)用日趨廣泛[1]，美國研究發(fā)現(xiàn)L-鳥氨酸可以用作促進(jìn)生長激素的分泌，以增強(qiáng)肌肉合成和提高基礎(chǔ)代謝及預(yù)防肥胖[2]，在歐洲鳥氨酸也作為膳食藥物來銷售，日本研究者發(fā)現(xiàn)L-鳥氨酸也可以作為食品類原料[3-4]。目前在國際市場上，L-鳥氨酸的絕大部分市場份額被日本占據(jù)，國內(nèi)有少數(shù)幾家生產(chǎn)，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥氨酸研究具有重大的經(jīng)濟(jì)意義和理論意義[5]。但是，國內(nèi)發(fā)酵法生產(chǎn)鳥氨酸也面臨著資源浪費(fèi)和環(huán)境污染的嚴(yán)重問題[6]。在微生物發(fā)酵過程中，發(fā)酵末期的菌體不是目的產(chǎn)物，因此會產(chǎn)生大量的廢菌渣固形物，其處理方法是將廢菌渣固形物在污水處理廠中分解或是燃燒處理,這不僅污染環(huán)境、破壞生態(tài)，也造成了嚴(yán)重的資源和能源浪費(fèi)[7-10]。本研究擬借鑒國內(nèi)外的其它發(fā)酵行業(yè)的廢菌渣固形物利用的經(jīng)驗(yàn)，開發(fā)谷氨酸棒桿菌廢菌絲體的綜合回收利用工藝，以期能顯著減少廢液的排放量、節(jié)約資源、避免環(huán)境污染，為國內(nèi)L-鳥氨酸工業(yè)化高效環(huán)保生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，對促進(jìn)國內(nèi)發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥氨酸的產(chǎn)業(yè)化和醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展有重要的意義。

1　材料與設(shè)備

1.1菌種和廢菌渣固形物

谷氨酸棒桿菌1006（Corynebacterium glutamicum 1006），用其進(jìn)行L-鳥氨酸發(fā)酵，發(fā)酵后期收集廢菌渣固形物以備用。

1.2主要儀器與試劑

葡萄糖、硫酸銨、七水合硫酸鎂、碳酸鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等均為分析純；酵母膏、蛋白胨、牛肉浸膏等均為生化試劑。

Cintra2020紫外-可見分光光度計(jì)：澳大利亞GBC公司；安捷倫1100高效液相色譜儀：美國安捷倫科技公司；AllTech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器：美國GRACE公司；HR/T20MM立式高速冷凍離心機(jī)：湖南赫西儀器有限公司；HYG-Ⅱ型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海彥承實(shí)業(yè)有限公司；GZX-9140 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱：上海儀純有限公司；SBA-40C型生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1保藏培養(yǎng)基

蛋白胨1.0 g/100 mL，牛肉膏0.5 g/100 mL，NaCl 0.5 g/100 mL，瓊脂2.0，pH 7.00～7.20。

1.3.2活化培養(yǎng)基

葡萄糖0.1 g/100 mL，蛋白胨1.0 g/100 mL，牛肉膏0.5 g/100 mL，NaCl 0.5 g/100 mL，瓊脂2.0 g/100 mL，pH 為7.00～7.20。

1.3.3種子培養(yǎng)基

葡萄糖2.5 g/100 mL，硫酸銨0.5 g/100 mL，硫酸鎂0.3g/100mL，酵母膏0.5 g/100 mL，碳酸鈣0.4 g/100 mL，少量磷酸鹽和生長因子，pH為7.60～7.80。滅菌條件：121.0℃，保溫10 min。

1.3.4發(fā)酵培養(yǎng)基

1.3.4.1以酵母膏為有機(jī)氮源

葡萄糖9.0 g/100 mL，硫酸銨2.5 g/100 mL，硫酸鎂0.4 g/100 mL，酵母膏3.0 g/100 mL，碳酸鈣1.0 g/100 mL，少量的無機(jī)磷酸鹽和生長因子，pH為7.60～7.80。滅菌條件：121.0℃保溫10 min。

1.3.4.2以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源

葡萄糖9.0 g/100 mL，硫酸銨2.5 g/100 mL，硫酸鎂0.4 g/100 mL，廢菌渣固形物水解液6.5 g/100 mL，碳酸鈣1.0 g/100 mL，少量的無機(jī)磷酸鹽和生長因子，pH為7.60～7.80。滅菌條件：121.0℃保溫10 min。

2　方法

2.1指標(biāo)測定方法

2.1.1發(fā)酵液OD值的測定

鳥氨酸發(fā)酵液中含碳酸鈣，用一定濃度的HCl溶液溶解碳酸鈣，將發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)，在660 nm波長下測吸光度OD值。

2.1.2L-鳥氨酸含量的測定

采用HPLC-ELSD法定量測定L-鳥氨酸的含量。色譜柱為Prevail C18（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm），流動相為0.14%三氟乙酸（含0.06%七氟丁酸）溶液-乙腈溶液（88∶22）。在流動相流量為0.8 mL/min，氣體流量為2.8 mL/min，ELSD檢測器漂移管溫度為110℃，進(jìn)樣量為20 μL的色譜條件下，將不同濃度的L-鳥氨酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以峰面積為橫坐標(biāo)，L-鳥氨酸鹽酸鹽濃度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程C=1.382 64×10-7A+0.059 37（r=0.999 7）。利用外標(biāo)法，將樣品的峰面積代入回歸方程中，即可求得樣品中L-鳥氨酸鹽酸鹽的濃度。

2.1.3殘?zhí)橇康臏y定

采用SBA-40C型生物傳感分析儀測定殘?zhí)恰?.2廢菌渣固形物的水解方法及條件的確定

本試驗(yàn)采用硫酸水解法進(jìn)行廢菌渣固形物的水解。經(jīng)單因素水解試驗(yàn)，選擇合適的酸濃度、廢菌渣固形物的比例及溫度3個(gè)因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1　Orthogonal test

2.3廢菌渣固形物水解時(shí)間對L-鳥氨酸發(fā)酵的影響

用硫酸溶液直接水解含水廢菌渣固形物，水解時(shí)間不同菌體的水解程度也不同，取一定廢菌渣固形物在一定的水解條件下分別水解不同時(shí)間，然后用于發(fā)酵并檢測發(fā)酵產(chǎn)物量，以確定最佳水解時(shí)間。

2.4調(diào)廢菌渣固形物水解液pH的方式對L-鳥氨酸發(fā)酵的影響

廢酵母水解液新鮮制取時(shí)，pH較低，要用較多的堿性物質(zhì)進(jìn)行調(diào)pH。本試驗(yàn)分別采用CaO、NaOH、NH3· H2O對廢菌渣固形物水解液回調(diào)pH至7.60～7.80。按搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方，進(jìn)行發(fā)酵并考察試驗(yàn)結(jié)果。

2.5添加廢菌渣固形物水解液含量的確定

在一定的發(fā)酵培養(yǎng)基上依次加不同量的硫酸廢菌渣固形物水解液代替購買的硫酸水解的酵母水解液進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，并檢測試驗(yàn)結(jié)果。

2.6連續(xù)回用廢菌渣固形物水解液進(jìn)行L-鳥氨酸發(fā)酵的分析

以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行一定批數(shù)搖瓶發(fā)酵，并檢測試驗(yàn)結(jié)果?？疾霯-鳥氨酸發(fā)酵產(chǎn)物量穩(wěn)定性。

3　結(jié)果與分析

3.1水解廢菌渣固形物條件的確定

若是將廢酵母先烘干再進(jìn)行加酸進(jìn)行水解廢酵母，不僅工序繁多，而且造成能源浪費(fèi)。根據(jù)表1中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)對廢菌渣固形物直接水解試驗(yàn)，結(jié)果如表2。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2　The orthogonal experiment results and analysis

運(yùn)用極差分析法對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，從表2可以看出，水解廢菌渣固形物最佳條件為：水解溫度為90.0℃，6.0 mol/L硫酸溶液（mL）：廢菌渣固形物（g）為1∶2.5。

3.2廢菌渣固形物水解時(shí)間對L-鳥氨酸發(fā)酵影響的確定

通過正交試驗(yàn)確定了廢菌渣固形物水解的主要條件，本試驗(yàn)中采用硫酸溶液直接水解含水菌體，水解時(shí)間對L-鳥氨酸發(fā)酵也有一定的影響，在水解溫度為90.0℃，6.0 mol/L硫酸溶液（mL）：廢菌渣固形物（g）為1∶2.5的條件下對濕菌體進(jìn)行水解，在水解時(shí)間為10、15、20、25、30、35 h進(jìn)行取樣，并按1.3.4.2以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源的配方分別用于發(fā)酵，另外按1.3.4.1以酵母膏為有機(jī)氮源設(shè)置對照組，并檢測發(fā)酵情況，以確定最佳水解時(shí)間。結(jié)果見表3。

表3　水解時(shí)間對L-鳥氨酸發(fā)酵的影響Table 3　Effects of hydrolysis time on the fermentation of ornithine

由表3可知，當(dāng)水解時(shí)間超過20 h，L-鳥氨酸產(chǎn)量接近對照組，低于20 h水解的不徹底，L-鳥氨酸產(chǎn)量不高，隨著水解時(shí)間的延長，對L-鳥氨酸發(fā)酵影響不大，為了確保水解的充分性，水解時(shí)間安排在20 h為最佳。

3.3pH調(diào)節(jié)方式對L-鳥氨酸發(fā)酵的影響

按3.1方法制取的新鮮廢菌渣固形物水解液，pH較低，要用堿性物質(zhì)調(diào)pH。本試驗(yàn)分別采用了CaO、NaOH、NH3·H2O對廢菌渣固形物水解液回調(diào)pH至7.60～7.80。進(jìn)行發(fā)酵的試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4　調(diào)pH的方式對L-鳥氨酸發(fā)酵的影響Table 4　Effects of the methods of controlling pH on thefermentation of ornithine

可以看出，用氨水回調(diào)pH得到的L-鳥氨酸含量最高為36.87 g/L，可能是用其它兩種物質(zhì)回調(diào)pH，帶來了大量的Na+和Ca2+，Na+較多，會對鈉、鉀ATP酶系統(tǒng)造成影響，而ATP水解直接偶聯(lián)L-鳥氨酸的運(yùn)輸，雖然CaSO4微溶于水，但是Ca2+可以和磷酸鹽和磷酸氫鹽反應(yīng)生成沉淀，在中性和堿性條件下尤為如此，這樣就會引起磷酸鹽的降低。

故可知廢菌渣固形物水解液制備的工藝為溫度為90.0℃、6.0 mol/L硫酸溶液（mL）：廢菌渣固形物（g）為1∶2.5、水解時(shí)間為20 h，將制取的水解液用氨水調(diào)解pH調(diào)至7.60～7.80。

3.4添加廢菌渣固形物水解液含量的確定

L-鳥氨酸發(fā)酵水平的高低和廢菌渣固形物水解液用量之間存在著密切關(guān)系，即L-鳥氨酸的產(chǎn)量會隨著廢菌渣固形物水解液的濃度發(fā)生改變。添加廢菌渣固形物水解液含量的梯度試驗(yàn)對于確定添加廢菌渣固形物水解液的最佳含量十分必要。按1.3.4.2以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源的配方在100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基上依次用3.5、5.0、6.5、8.0、9.5 g硫酸廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源，以酵母膏為有機(jī)氮源設(shè)置對照組，檢測發(fā)酵結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5　廢菌渣固形物水解液含量對L-鳥氨酸發(fā)酵的影響Table 5　Effects of the hydrolysate content of the fermentation residues

從表5可以看出發(fā)酵液OD值隨廢菌渣固形物水解液的增加而遞增，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中含廢菌渣固形物水解液6.5 g/100 mL，L-鳥氨酸產(chǎn)量最高，達(dá)到了37.47 g/L，說明了用自制廢菌渣固形物水解液取代發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母膏是成功的，試驗(yàn)結(jié)果超過了對照組發(fā)酵培養(yǎng)基的水平，可能是因?yàn)閺U菌渣固形物水解成水解液之后，沒有經(jīng)過較大的后續(xù)處理，直接當(dāng)作有機(jī)氮源使用，其營養(yǎng)成分比經(jīng)過后續(xù)處理的酵母膏豐富所致。

3.5連續(xù)回用廢菌渣固形物水解液進(jìn)行L-鳥氨酸發(fā)酵的研究

第1批按1.3.4.1以酵母膏為有機(jī)氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，氨水調(diào)節(jié)初始pH至7.6～7.8，按5%接種量將種子液接入裝有50mL的發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，8層紗布封口，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上（220 r/min），30℃振蕩培養(yǎng)72 h。檢測發(fā)酵過程中最大OD及72 h鳥氨酸產(chǎn)量，發(fā)酵后期收集廢菌渣固形物，制備成具體水解液后，按6.5 g/100 mL廢菌渣固形物水解液量加到發(fā)酵液中，其他按第1批發(fā)酵情況進(jìn)行第2批發(fā)酵，以此類推連續(xù)進(jìn)行到第8批發(fā)酵，分別檢測每批發(fā)酵過程中最大OD及72 h鳥氨酸產(chǎn)量。以發(fā)酵批數(shù)為橫坐標(biāo)，以每批發(fā)酵過程中最大OD及72 h鳥氨酸產(chǎn)量為縱坐標(biāo)繪圖。繪制結(jié)果如圖1所示。

圖1　不同批次發(fā)酵過程中最大OD及L-鳥氨酸產(chǎn)量Fig.1　Maximum OD and production of L-ornithine in different batches of fermentation

由圖1所示可知用水解溫度為90.0℃，6.0 mol/L硫酸溶液（mL）：廢菌渣固形物（g）為1∶2.5，水解時(shí)間20 h以上，廢菌渣固形物水解液加入量為6.5 g/100 mL的條件進(jìn)行發(fā)酵，由多批次發(fā)酵過程中最大OD值和L-鳥氨酸產(chǎn)量表明菌體生物量穩(wěn)定，鳥氨酸產(chǎn)量穩(wěn)定，表明該工藝可行。

4　總結(jié)

本文主要研究了L-鳥氨酸發(fā)酵廢菌渣固形物水解液的制備工藝，并將其回用于L-鳥氨酸的發(fā)酵工藝上，得出如下結(jié)論：

1）通過正交試驗(yàn)法和單因素試驗(yàn)法，對直接利用含水廢菌渣固形物制取廢菌渣固形物水解液的操作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并確定了廢菌渣固形物水解液替代酵母膏的最佳用量、水解廢菌渣固形物的時(shí)間和調(diào)pH的最佳方式，達(dá)到用酵母膏時(shí)的產(chǎn)酸水平。得到L-鳥氨酸發(fā)酵廢菌渣固形物水解液回用工藝最佳條件為：水解溫度為90.0℃、6.0 mol/L硫酸溶液（mL）與含水廢菌渣固形物（g）之比為1∶2.5、水解液加入量為6.5 g/100 mL。

2）通過連續(xù)回用廢菌渣固形物水解液進(jìn)行L-鳥氨酸發(fā)酵，其L-鳥氨酸產(chǎn)量穩(wěn)定。

3）分別以酵母膏為有機(jī)氮源和以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基檢測，L-鳥氨酸產(chǎn)量相差無幾，完全可以用廢菌渣固形物水解液代替酵母膏進(jìn)行鳥氨酸發(fā)酵生產(chǎn)。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.025

收稿日期：2015-08-05

作者簡介：耿曉玲（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品工程、食品安全。

Study on Reuse Process of Hydrolysis Solids of L-ornithine Fermentation Residues

GENG Xiao-ling1，CAI Li1，WANG Jun-hua2，WANG Peng1
（1.Department of Chemical and Textile Engineering，Jiangyin Polytechnic College，Jiangyin 214431，Jiangsu，China；2.Food Safety Testing Center of Jiangyin District，Jiangyin 214431，Jiangsu，China）

Abstract：Hydrolysis solids of L-ornithine fermentation residues were used as the organic nitrogen source to study the production of L-ornithine by fermentation.The optimized conditions of reuse process were as follows：hydrolysis time 20 h，hydrolysis temperature 90.0℃，hydrolysate 6.5 g/100 mL，the ratio was 1∶2.5 of 6.0 mol/L H2SO4solution（mL）：fungi residues solids containing water（g）.Finally，37.47 g/L of L-ornithine was obtained under these conditions，which was no difference compared with the control group.The yield of the L-ornithine obtained from the continuous reuse process was stable.

Key words：L-ornithine；fermentation residues；orthogonal array design；process conditions