謝利，王芬，曾瑞珍，郭和蓉，周玉亮，張志勝

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農(nóng)桿菌介導(dǎo)的墨蘭遺傳轉(zhuǎn)化

謝利，王芬，曾瑞珍，郭和蓉，周玉亮，張志勝

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東省植物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642

謝利, 王芬, 曾瑞珍, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的墨蘭遺傳轉(zhuǎn)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(4): 542-551.Xie L, Wang F, Zeng RZ, et al. Agrobacterium-mediated transformation of Cymbidium sinensis. Chin J Biotech, 2015, 31(4): 542-551.

轉(zhuǎn)基因育種是快速定向改良蘭花育種目標(biāo)性狀的有效方法，但迄今未見(jiàn)有關(guān)墨蘭轉(zhuǎn)基因育種的研究報(bào)道。試驗(yàn)以‘企劍白墨’墨蘭cv‘Qijianbaimo’ 的根狀莖為受體材料，研究了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)墨蘭遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素，以建立有實(shí)用價(jià)值的墨蘭遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。結(jié)果表明，受體的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、乙酰丁香酮的添加方式及濃度、農(nóng)桿菌工程菌液濃度 (600)、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間均對(duì)‘企劍白墨’根狀莖的GUS瞬時(shí)表達(dá)率有顯著影響。以預(yù)培養(yǎng)39 d的根狀莖尖為材料，在添加200 μmol/L乙酰丁香酮，600為0.9的工程菌液中侵染35 min后，轉(zhuǎn)入添加200 μmol/L乙酰丁香酮的共培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d時(shí)，‘企劍白墨’根狀莖的GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，為11.67%。采用上述條件對(duì)‘企劍白墨’墨蘭進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR鑒定和GUS染色檢測(cè)，從400 株再生植株中獲得了3 株轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率為0.75%。研究表明通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)墨蘭進(jìn)行遺傳改良是可行的。

墨蘭，農(nóng)桿菌介導(dǎo)，遺傳轉(zhuǎn)化，根狀莖

墨蘭香氣濃郁、花枝挺俊、葉姿矯健，由于其在春節(jié)期間開(kāi)花，已成為年宵花的重要種類之一，也是出口量最大的國(guó)蘭之一。因此，加快墨蘭新品種的選育對(duì)推動(dòng)我國(guó)蘭花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，提高蘭花產(chǎn)業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義[1]。

墨蘭新品種選育多采用引種馴化結(jié)合選擇育種的方法，但該方法不僅造成對(duì)蘭花資源的破壞，而且難以獲得突破性的品種。近年來(lái)雜交育種已成為墨蘭育種的主要方法，但由于雜交育種年限長(zhǎng)，目前采用該方法培育出的墨蘭新品種也比較少，不能滿足產(chǎn)業(yè)發(fā)展對(duì)新品種的要求。因此進(jìn)一步研究墨蘭育種方法對(duì)加快墨蘭新品種選育，培育出有良好產(chǎn)業(yè)化前景的墨蘭新品種具有重要意義。

轉(zhuǎn)基因育種是快速培育觀賞植物新品種的有效途徑，迄今通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法已實(shí)現(xiàn)對(duì)觀賞植物的株型、花色、花型、花期、觀賞期、貨架期、抗性等主要育種目標(biāo)性狀的有效改良，獲得了50多種轉(zhuǎn)基因觀賞植物[2]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是轉(zhuǎn)基因育種的主要方法[3]，在蘭科Orchidaceae植物中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已對(duì)蘭屬[4-6]、蝴蝶蘭[7-11]、石斛蘭[12-16]、卡特蘭[17]和文心蘭[18]等進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，但尚未見(jiàn)到農(nóng)桿菌介導(dǎo)墨蘭遺傳轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道。本試驗(yàn)以‘企劍白墨’墨蘭cv‘Qijianbaimo’根狀莖為受體材料，研究了預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、乙酰丁香酮 (Acetosyringone, AS) 的添加方式及濃度、工程菌液濃度 (600)、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)墨蘭遺傳轉(zhuǎn)化的影響，旨在建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的墨蘭遺傳轉(zhuǎn)化體系，為利用轉(zhuǎn)基因方法培育墨蘭新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因受體材料為‘企劍白墨’墨蘭 (下稱白墨) 莖尖培養(yǎng)形成的根狀莖 (圖1A)，由課題組誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)產(chǎn)生。根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105，供試質(zhì)粒為pCAMBIA 1305，啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子，T-DNA區(qū)含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和β-葡萄糖苷酸酶基因，農(nóng)桿菌菌株和質(zhì)粒由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉向東教授課題組惠贈(zèng)。

1.2 工程菌液的制備

挑取已活化的單菌落接種于含有50 mg/L Kan (硫酸卡那霉素) 和50 mg/L Rif (利福平) 的YEB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24–36 h，待菌液600值約為1.0左右時(shí)，室溫7 000 r/min離心10 min，收集菌體，用配制好的懸浮培養(yǎng)基 (YEB液體培養(yǎng)基：MS液體培養(yǎng)基(∶)=1∶2，pH 5.2) 重新懸浮至600為0.9左右時(shí)備用。

1.3 影響白墨遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素

選取生長(zhǎng)旺盛、帶有幼嫩莖尖的根狀莖，在繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，選擇生長(zhǎng)良好的根狀莖，在無(wú)菌條件下將其前端約1.0 cm長(zhǎng)的幼嫩根狀莖尖切下，并在其表面輕輕劃出傷痕，然后將其浸入制備好的工程菌液中進(jìn)行侵染 (期間不斷振蕩使菌液與根狀莖充分接觸)，倒掉菌液，取出根狀莖，用無(wú)菌濾紙吸干根狀莖尖表面的多余菌液，轉(zhuǎn)入鋪有濾紙的共培養(yǎng)基中，在黑暗條件下進(jìn)行共培養(yǎng)。共培養(yǎng)基為：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉粉7.5 g/L，pH值為5.8。

1.3.1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間

將預(yù)培養(yǎng)0、36、37、39和41 d的根狀莖在添加200 μmol/L AS、600值為0.8的工程菌液中侵染35 min后，轉(zhuǎn)入添加200 μmol/L AS的共培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率。

1.3.2 工程菌液濃度

將預(yù)培養(yǎng)39 d的根狀莖在添加200 μmol/L AS、600值分別為0.2、0.4、0.6、0.9和1.2的工程菌液中侵染35 min，轉(zhuǎn)入添加200 μmol/L AS的共培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率。

1.3.3 侵染時(shí)間

將預(yù)培養(yǎng)39 d的根狀莖在添加200 μmol/L AS、600值為0.7的工程菌液中分別侵染15、25、30、35、40和45 min后，轉(zhuǎn)入添加200 μmol/L AS的共培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率。

1.3.4 AS的添加方式及濃度

將預(yù)培養(yǎng)39 d的根狀莖在添加不同濃度AS、600值為0.8的工程菌液中侵染35 min后，轉(zhuǎn)入添加不同濃度AS的共培養(yǎng)基中培養(yǎng) 7 d后統(tǒng)計(jì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率。

1.3.5 共培養(yǎng)時(shí)間

將預(yù)培養(yǎng)39 d的根狀莖在添加200 μmol/L AS、600值為0.7的工程菌液中侵染35 min后，轉(zhuǎn)入添加200 μmol/L AS的共培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)3、5、6、7和9 d后統(tǒng)計(jì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率。

1. 4 GUS瞬時(shí)表達(dá)率

在共培養(yǎng)完成后，每個(gè)處理隨機(jī)取40 條根狀莖，用水洗凈表面沾粘的菌絲，吸干水分，浸泡于X-gluc染液中，37 ℃黑暗條件下處理 18 h，然后用現(xiàn)配的卡諾液 (無(wú)水乙醇∶冰乙酸=3∶1) 脫色，觀測(cè)染色情況，并統(tǒng)計(jì)GUS瞬時(shí)表達(dá)率，以無(wú)菌水處理的根狀莖作為陰性對(duì)照。GUS瞬時(shí)表達(dá)率 (%)=(顯色根狀莖數(shù))/(檢測(cè)總根狀莖數(shù))×100。

1.5 白墨的遺傳轉(zhuǎn)化

1.5.1 侵染和共培養(yǎng)

將預(yù)培養(yǎng)39 d的白墨根狀莖在添加 200 μmol/L AS、600約為0.9的工程菌液中侵染35 min，然后轉(zhuǎn)入添加200 μmol/L AS的共培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d。

1.5.2 脫菌篩選培養(yǎng)

用含有250 mg/L頭孢霉素的無(wú)菌水將經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的根狀莖沖洗3–4次，吸干多余水分后，將根狀莖轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+頭孢霉素250 mg/L+潮霉素B 50 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉粉7.5 g/L (pH 5.8，下同) 中進(jìn)行脫菌培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化體篩選，每?jī)芍苻D(zhuǎn)接1次，轉(zhuǎn)接時(shí)切除褐化及壞死的根狀莖部分。篩選2–3次后，將根狀莖轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+頭孢霉素250 mg/L+椰子汁200 mL/L+蔗糖 40 g/L+卡拉粉7.5 g/L中分化成苗，將株高1.5 cm左右的小苗接種于生根培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+香蕉80 g/L+蔗糖 40 g/L+卡拉粉7.5 g/L上進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)。

1.6 轉(zhuǎn)化植株的鑒定

1.6.1 PCR鑒定

設(shè)計(jì)出檢測(cè)基因(371 bp) 的1對(duì)引物，上游序列為5′-ACGTCCTGTAGAAACCCCAAC C-3′，下游序列為5′-TCCCGGCAATAACATACG GCGT-3′，由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。采用改良CTAB法提取白墨試管苗葉片基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照、未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的植株葉片為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系：10× PCR緩沖液2 μL，dNTPs 0.2 μL，上下游引物各1.5 μL，5 U酶 0.2 μL，模板DNA 2 μL，超純水補(bǔ)齊。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，吸取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后在紫外凝膠成像儀上成像并拍照。共檢測(cè)400株經(jīng)抗性篩選的組培苗，按下述公式計(jì)算轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率 (%)=(PCR陽(yáng)性的苗數(shù))/(檢測(cè)的苗數(shù))′100。

1.6.2 GUS組織化學(xué)染色法檢測(cè)

在無(wú)菌條件下，切取少量經(jīng)PCR檢測(cè)為轉(zhuǎn)基因植株的葉片和根尖，放入2.0 mL離心管中，加入X-gluc染液，蓋緊蓋子，37 ℃水浴18 h；倒掉X-gluc染液，加入卡諾固定液脫色；數(shù)小時(shí)后，觀察染色情況，在Olympus PM-20型體視鏡下進(jìn)行鏡檢，并拍照。

2 結(jié)果

2.1 影響白墨根狀莖遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素

2.1.1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間

預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)白墨根狀莖的GUS瞬時(shí)表達(dá)率有顯著影響 (表1)。預(yù)培養(yǎng)39 d時(shí)瞬時(shí)表達(dá)率最高，為6.67%；預(yù)培養(yǎng)36、37和41 d的瞬時(shí)表達(dá)率與對(duì)照差異不顯著。因此，在白墨的遺傳轉(zhuǎn)化中，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間以39 d為宜。

2.1.2 AS的添加方式及濃度

AS的添加方式及濃度對(duì)白墨根狀莖的GUS瞬時(shí)表達(dá)率有顯著影響 (表2)。工程菌液和共培養(yǎng)基中均不添加AS時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率為0；僅在工程菌液中添加AS時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率與不添加AS無(wú)顯著差異；在工程菌液和共培養(yǎng)基中均添加200 μmol/L AS時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率最高，而添加300 μmol/L AS時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率顯著下降。因此，在白墨的遺傳轉(zhuǎn)化中，在工程菌液和共培養(yǎng)基中均添加200 μmol/L AS可提高轉(zhuǎn)化效率。

2.1.3 工程菌液濃度

工程菌液濃度對(duì)白墨根狀莖的GUS瞬時(shí)表達(dá)率有顯著影響 (表3)。600為0.2時(shí)瞬時(shí)表達(dá)率為0；600為0.2–0.9時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率隨600值的增大而增大；600為0.9時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率最高，為11.67%。因此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)白墨的遺傳轉(zhuǎn)化中，工程菌液的600值為0.9左右比較合適。

2.1.4 侵染時(shí)間

侵染時(shí)間對(duì)白墨根狀莖的GUS瞬時(shí)表達(dá)率影響顯著 (表4)。侵染時(shí)間為15 min時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率為0；隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，瞬時(shí)表達(dá)率逐漸升高；侵染時(shí)間為35 min和40 min時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率無(wú)顯著差異；當(dāng)侵染時(shí)間為40 min時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率最高，為10.0%；當(dāng)侵染時(shí)間為 45 min時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率顯著下降。因此，在白墨的遺傳轉(zhuǎn)化中，侵染時(shí)間為35–40 min比較適宜。

表1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)白墨根狀莖GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響

Note:a, bin a column mean significant difference in different samples (<0.05).

表2 AS對(duì)白墨根狀莖GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響

Note:a, bin a column mean significant difference in different samples (<0.05).

2.1.5 共培養(yǎng)時(shí)間

共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)白墨根狀莖的GUS瞬時(shí)表達(dá)率有顯著影響 (表5)。共培養(yǎng)3 d時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率為0；隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，瞬時(shí)表達(dá)率逐漸升高；共培養(yǎng)7 d時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率最高；共培養(yǎng)6–9 d時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率差異不明顯。但共培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，根狀莖受到的毒害越大。因此，在白墨的遺傳轉(zhuǎn)化中，共培養(yǎng)時(shí)間以7 d為宜。

2.2 墨蘭的遺傳轉(zhuǎn)化和再生植株的檢測(cè)

2.2.1 墨蘭的遺傳轉(zhuǎn)化和植株再生

取預(yù)培養(yǎng)39 d的根狀莖(圖1A)，表面輕輕劃傷后浸入添加200 μmol/L AS、600為0.9的工程菌液中侵染35 min，轉(zhuǎn)入添加200 μmol/L AS的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)7 d，經(jīng)轉(zhuǎn)化體篩選 (圖1B)、芽分化 (圖1C) 和植株再生，獲得了1批轉(zhuǎn)化植株 (圖1D)。

表3 菌液濃度對(duì)白墨根狀莖GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響

Note:a, bandcin a column mean significant difference in different samples (<0.05).

表4 侵染時(shí)間對(duì)白墨根狀莖GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響

Note:a, bandcin a column mean significant difference in different samples (<0.05).

表5 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)白墨根狀莖GUS瞬時(shí)表達(dá)率的影響

Note:a, bandcin a column mean significant difference in different samples (<0.05).

圖1 墨蘭遺傳轉(zhuǎn)化體系

2.2.2 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)

從轉(zhuǎn)化植株中隨機(jī)選取400株進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，有3株擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照同樣大小的目的條帶 (371 bp)，其余植株未擴(kuò)增出目的條帶 (圖2)。對(duì)3株P(guān)CR擴(kuò)增為陽(yáng)性的植株葉片和根尖進(jìn)行GUS染色，轉(zhuǎn)化植株葉片的切口邊緣 (圖3A) 及根尖 (圖3B) 均呈現(xiàn)藍(lán)色，表明基因在轉(zhuǎn)化植株中已表達(dá)。

3 討論

墨蘭是具有重要的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和文化價(jià)值的國(guó)蘭之一，市場(chǎng)前景廣闊，但新品種選育滯后限制了其產(chǎn)業(yè)高效可持續(xù)發(fā)展。本研究首次以‘企劍白墨’墨蘭根狀莖為受體，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的墨蘭遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，成功地將基因轉(zhuǎn)入‘企劍白墨’墨蘭中。這為今后利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育墨蘭新品種奠定了基礎(chǔ)，對(duì)其他以根狀莖為受體的國(guó)蘭遺傳轉(zhuǎn)化研究也有重要的參考價(jià)值。

圖2 墨蘭轉(zhuǎn)基因植株gus基因的PCR檢測(cè)

圖3 墨蘭轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色檢測(cè)

在蘭花的遺傳轉(zhuǎn)化中，受體材料多為類原球莖 (PLBs)，而以根狀莖為受體的研究報(bào)道較少。Chen等[6]用600值為1.0的LBA4404菌液侵染玉花蘭的根狀莖，瞬時(shí)表達(dá)率高達(dá)100%，經(jīng)過(guò)15個(gè)月的繼代培養(yǎng)，根狀莖的GUS表達(dá)率為31.3%，芽分化培養(yǎng)中芽的GUS表達(dá)率為58.3%，但未獲得轉(zhuǎn)基因植株。墨蘭是蘭花中較難進(jìn)行組織培養(yǎng)的種類之一，不管是種子萌發(fā)還是莖尖培養(yǎng)最后均形成根狀莖[19]，由于墨蘭根狀莖的增殖速度慢、分化成苗難，且對(duì)農(nóng)桿菌侵染不敏感，因此較難進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果也表明，用600值為0.9的EHA105菌液侵染墨蘭根狀莖，GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高為11.67%，但轉(zhuǎn)化效率僅為0.75%，遺傳轉(zhuǎn)化效率偏低。

影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素包括農(nóng)桿菌菌株及其生長(zhǎng)狀態(tài)和菌液濃度、載體、受體材料及其生長(zhǎng)狀態(tài)、基因的活化、侵染方式、共培養(yǎng)時(shí)間和溫度、pH值、培養(yǎng)基成分、超聲波處理和表面活性劑處理等[20-28]。本研究結(jié)果表明，受體的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、工程菌液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間均對(duì)白墨根狀莖的GUS瞬時(shí)表達(dá)率有顯著影響，受體材料不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)、工程菌液濃度低、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間短均不利于墨蘭的遺傳轉(zhuǎn)化。這與Chen等[6]在玉花蘭上獲得的適宜侵染時(shí)間為0.5–1.5 h，共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響不明顯的結(jié)果不一致，其可能的原因是與材料不同、菌株不同等有關(guān)。本研究結(jié)果還表明在工程菌液中不添加AS，GUS瞬時(shí)表達(dá)率為0，說(shuō)明添加AS對(duì)基因進(jìn)行活化是墨蘭遺傳轉(zhuǎn)化所必需的，在工程菌液和共培養(yǎng)基中同時(shí)添加200 μmol/L AS時(shí)，墨蘭根狀莖的GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，表明200 μmol/L AS有利于墨蘭的遺傳轉(zhuǎn)化，這與在文心蘭遺傳轉(zhuǎn)化[18]中使用的AS濃度一致，而與在玉花蘭[6]、大花蕙蘭[5]、蝴蝶蘭[9]、石斛蘭[14]、卡特蘭[17]等中使用的100 μmol/L濃度不同。選擇合適的農(nóng)桿菌菌株與高效的表達(dá)載體是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中至關(guān)重要的因素[14,28]。本研究選用了對(duì)單子葉植物轉(zhuǎn)化效率高的EHA105侵染白墨根狀莖，并沒(méi)有獲得高的遺傳轉(zhuǎn)化效率，這是由于品種敏感性不同造成的，還是其他方面的原因有待進(jìn)一步研究。

由于墨蘭根狀莖苗分化能力弱，導(dǎo)致部分轉(zhuǎn)化的細(xì)胞未能分化出植株；同時(shí)根狀莖表面粗糙且通常有大量根毛狀物生長(zhǎng) (圖1A和1B)，會(huì)減弱農(nóng)桿菌在根狀莖上的附著；再加上在繼代和芽分化培養(yǎng)時(shí)根狀莖極易褐化，也會(huì)影響農(nóng)桿菌對(duì)墨蘭根狀莖的轉(zhuǎn)化。因此，選擇苗分化能力強(qiáng)的受體材料、對(duì)受體根狀莖進(jìn)行真空或超聲波處理、在侵染過(guò)程中使用表面活性劑以及在共培養(yǎng)基中添加抗氧化劑可能是進(jìn)一步提高墨蘭根狀莖遺傳轉(zhuǎn)化效率的有效 措施。

REFERENCES

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

-mediatedtransformation of

Li Xie, Fen Wang, Ruizhen Zeng, Herong Guo, Yuliang Zhou, and Zhisheng Zhang

Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China

Genetic transformation is an effective method to improve breeding objective traits of orchids. However, there is little information about genetic transformation of.Rhizomes from shoot-tip culture ofcv. ‘Qijianbaimo’ were used to establish a practical transformation protocol of. Pre-culture time, concentration and treating methods of acetosyringone, concentration of infection bacteria fluid (600), infection time, and co-culture time had significant effects onβ-glucuronidase (GUS) transient expression rate ofcv. ‘Qijianbaimo’ rhizome. The GUS transient expression rate of rhizome was the highest (11.67%) when rhizomes pre-cultured for 39 d were soaked in bacterium suspension (600=0.9) supplemented with 200 μmol/Lacetosyringone for 35 min, followed by culturing on co-culture medium supplemented with 200 μmol/Lacetosyringone for 7 d. Under this transformation conditions, 3 transgenic plantlets, confirmed by GUS histochemical assay and PCR, were obtained from 400 regenerated plantlets, and the genetic transformation rate was 0.75%. This proved that it was feasible to create new cultivars by the use of-mediated genetic transformation in.

,-mediated, genetic transformation, rhizome

July 7, 2014; Accepted: October 14, 2014

Zhisheng Zhang. Tel: +86-20-38297154; Fax: +86-20-85288377; E-mail: zszhang@scau.edu.cn

Supported by: The Agricultural Key Science and Technology Project of Guangdong Province (No. 2007A020300009-3), the Combination of Production and Research Project of the Ministry of Education in Guangdong Province (No. 2012B091100480).

廣東省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目 (No. 2007A020300009-3)，廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目 (No. 2012B091100480) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-11-05

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140358.html