高運華，陳鴻飛，盛靈慧，武利慶，王晶

（1.中國計量科學(xué)研究院，北京100029；2.南京市計量監(jiān)督檢測院，江蘇南京210037）

DNA甲基化定量測量國際比對CCQM P94.2

高運華1，陳鴻飛2，盛靈慧1，武利慶1，王晶1

（1.中國計量科學(xué)研究院，北京100029；2.南京市計量監(jiān)督檢測院，江蘇南京210037）

建立基因組DNA基質(zhì)中CDKN2A基因甲基化含量的液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜法和Sanger序列測定法兩種定量方法，應(yīng)用于國際物質(zhì)量咨詢委員會（consultative committee for amount of substance，CCQM）開展的DNA甲基化定量測量國際比對（CCQM P94.2）研究?？疾霥NA甲基化效率、酶解條件、色譜分離條件等對測定結(jié)果的影響，評定測量結(jié)果的不確定度。液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜定量兩個比對未知樣的結(jié)果分別為未知樣1：64.5%±6.1%；未知樣2：46.7%±8.0%。Sanger序列測定法測定兩個比對未知樣的結(jié)果分別為未知樣1：48.9%±1.0%；未知樣2：48.9%±1.1%。與主導(dǎo)實驗室標準值未知樣1：51%±5.9%，未知樣2：46.9%±4.9%十分符合，為我國DNA甲基化定量測量標準物質(zhì)的研制奠定堅實的基礎(chǔ)。

DNA甲基化；同位素稀釋質(zhì)譜；Sanger測序；國際比對

0 引言

DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達[1-3]。DNA甲基化定量信息將有利于更好地解釋這些生物現(xiàn)象，并提升DNA甲基化相關(guān)疾病診斷的正確性。DNA甲基化定量分析的方法現(xiàn)已有多種，除了傳統(tǒng)的免疫、酶催化和化學(xué)方法外，高效毛細管電泳、高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用等現(xiàn)代儀器分析方法也取得顯著進展[4-6]。然而，沒有一種測量參考系統(tǒng)可以評價不同測量方法和不同測量儀器之間結(jié)果的一致性[7-8]。亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的方法是最方便而被廣泛應(yīng)用的技術(shù)，亞硫酸氫鹽將沒有甲基化的胞嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)化為尿嘧啶核苷酸，再通過PCR反應(yīng)轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶核苷酸，而甲基化的胞嘧啶核苷酸保持不變，PCR反應(yīng)轉(zhuǎn)化后仍為胞嘧啶核苷酸，通過測定胸腺嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸的含量變化實現(xiàn)甲基化的定量分析。但是，現(xiàn)在還沒有一個能夠充分評估其轉(zhuǎn)化反應(yīng)及后續(xù)分析過程（包括PCR反應(yīng)）偏差的方法，不能確保DNA甲基化分析結(jié)果的可比性、有效性[9-10]。因此，急需建立DNA甲基化測量標準方法，研制DNA甲基化方法和儀器評價相關(guān)的標準物質(zhì)。為了建立一個DNA甲基化標準測量系統(tǒng)，國際物質(zhì)量咨詢委員會生物工作組（CCQM BAWG）開展了DNA甲基化定量測量國際比對研究，該比對代號為CCQM P94.2，由韓國標準科學(xué)研究院（KRISS）主導(dǎo)，7個國家計量院參加，分別采用序列測定技術(shù)、熔點法、液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法、限制性內(nèi)切酶法等對樣品進行了定量比對分析。中國計量科學(xué)研究院實驗室采用了液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜和序列測定技術(shù)兩種方法參加了此次比對活動，取得了較好的結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜（Agilent 1290，Agilent公司）；質(zhì)譜儀（Qtrap 5500，AB Sciex公司）；PCR擴增儀（PTC0200，Bio-Rad公司）；瓊脂糖凝膠電泳儀（Power Pac系列，Bio-Rad公司）；紫外分光光度計（Beckman DU800，Beckman公司）；DNA序列分析儀（ABI 3500）。

DNA甲基化試劑盒（EZ DNA methylation kit D5002，Zymo），蛇毒磷酸二酯酶I（Phosphodiesterase I，Sigma）和DNA酶I（DNase I，Sigma），腺嘌呤脫氧核苷一磷酸（dAMP）標準物質(zhì)（GBW09805），胞嘧啶脫氧核苷一磷酸（dCMP）標準物質(zhì)（GBW09806），鳥嘌呤脫氧核苷一磷酸（dGMP）標準物質(zhì)（GBW09807），胸腺嘧啶脫氧核苷一磷酸（TMP）標準物質(zhì)（GBW09808）標準物質(zhì)，均來自中國計量科學(xué)研究院；dAMP-15N（Silantes公司），dCMP-13C15N（Silantes公司），dGMP-13C15N（Isotec公司），TMP-13C15N（劍橋同位素實驗室）。乙酸銨（色譜純，阿拉丁公司）；乙腈（色譜純，Merck公司）；實驗室用水來自Milli-Q超純水系統(tǒng)。比對樣品來自韓國標準科學(xué)研究院。

1.2 樣品亞硫酸鹽甲基化修飾

比對樣品共兩個，其中比對樣品1（U1）由比對主導(dǎo)實驗室利用亞硫酸鹽處理并純化，直接作為模板進行PCR擴增。未知樣2（U2）由參加實驗室進行亞硫酸鹽處理。首先取14μL DNA樣品，加入5μL M-Dilution緩沖溶液，再加入31μL超純水，混勻，37℃溫浴15min。然后加入100μL CT轉(zhuǎn)化試劑，混勻后，50℃暗處溫浴12～16h。然后將樣品置于冰上10min。利用試劑盒中的純化試劑將修飾后的樣品進行純化，純化后的樣本用于后續(xù)的PCR擴增。

1.3 比對樣品的PCR擴增和純化

PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 1μL；引物F4：GA GGGGAGTTAGGAATAAAATAA 1μL；R1：ACCACC ATCTTCCCACCCTCAA，1μL；AmpliTaq Gold PCR master mix 25μL，水22μL。熱反應(yīng)條件為：第1步，95℃，5min，1個循環(huán)；第2步，先94℃，30 s，然后58℃30s，最后72℃，30s，30個循環(huán)；第3步，72℃，7min，1個循環(huán)。反應(yīng)后的樣品用QIA quick PCR純化試劑盒進行純化，用瓊脂糖凝膠電泳進行產(chǎn)物檢驗。

1.4 DNA甲基化定量分析

1.4.1 DNA甲基化液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜（HPLCIDMS）定量分析

1）HPLC-IDMS分析條件優(yōu)化。利用核苷酸標準物質(zhì)、消解后的樣本對液相色譜和質(zhì)譜分析條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，使4種核苷酸dAMP，dGMP，dCMP，TMP之間及其他雜質(zhì)成分基線分離，然后利用優(yōu)化后的液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜定量測量條件，對酶解后的比對樣品進行了定量分析。

2）比對樣品的酶消解條件優(yōu)化及消解。系統(tǒng)優(yōu)化了Phosphodiesterase I酶用量和酶消解時間，具體的優(yōu)化方案見表1。

表1 酶反應(yīng)條件優(yōu)化方案

反應(yīng)結(jié)束后，置于65℃水浴中反應(yīng)20min滅活，置于4℃的冰箱中保存待測。校準樣品和未知樣品在相同的條件下進行酶解處理。

1.4.2 比對樣品甲基化含量的序列測定分析

將純化后的PCR產(chǎn)物，通過DNA連接酶插入DNA質(zhì)粒載體中，然后將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入大腸桿菌中，隨機挑取200個單菌落，進行DNA序列分析，通過統(tǒng)計計算得到其甲基化含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

比對樣品1、2，100%甲基化樣本M100和0%甲基化樣本M0，通過PCR擴增后產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電游分析可知，DNA分子量標準全部分開，條帶清晰，擴增產(chǎn)物處于200bp片段長度標準處，表明PCR擴增產(chǎn)物約200bp。另外上樣孔處干凈，證明樣品中蛋白質(zhì)成分含量極低，用瓊脂糖凝膠電泳方法不能檢出，圖中下部沒有明顯的亮色，證明擴增產(chǎn)物中RNA成分去除干凈。

2.2 HPLC-IDMS分析條件優(yōu)化

優(yōu)化后的液相色譜分析條件為：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3；流動相：（A相）5%乙腈-（B相）醋酸銨（pH=3.6）；梯度洗脫程序為：0～6min，100%B；6～8min，100%B降為98%B；8～12min，98%B降為60%B；12～20min，維持60%B；20～21min，60%B升為100%B；21～30min維持100%B。柱溫：25℃，進樣量：10μL。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件為：正離子掃描；多反應(yīng)檢測模式（MRM）；離子源溫度（TEM）650.00℃；離子源噴霧電壓5500.00V，霧化器（GS1）50.00L/h，輔助加熱器（GS2）40.00L/h；氣簾氣（CUR）30.00kPa。檢測離子對見表2。

利用優(yōu)化后的色譜質(zhì)譜分析條件對酶解后的比對樣品進行定量分析，分析結(jié)果見圖1。4種脫氧核苷酸在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜分析條件下達到基線分離，互不干擾，樣品濃度合適，峰高和峰面積滿足定量分析的要求。

表2 檢測離子對

圖1 脫氧核苷酸液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜分析

2.3 酶反應(yīng)條件的優(yōu)化

酶反應(yīng)條件主要從Phosphodiesterase I用量和水解時間兩方面進行優(yōu)化。利用液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜定量分析各反應(yīng)條件下的核苷酸含量，統(tǒng)計分析結(jié)果見圖2。

圖2 Phosphodiesterase I酶用量優(yōu)化

分析圖2可知，隨著Phosphodiesterase I量的增加，各核苷酸的量初期增加，達到1.1×10-2Unit時含量達到了最高，隨后產(chǎn)物的量趨于平衡并稍微減少，表明酶量在1.1×10-2Unit時較為合適，超過1.1×10-2Unit時產(chǎn)物趨于平衡或下降，原因可能是酶中含有雜質(zhì)，促使產(chǎn)物進一步降解所致。

酶水解時間的優(yōu)化結(jié)果見圖3，酶反應(yīng)時間在60min時產(chǎn)物量基本達到了平衡，最后確定了酶的優(yōu)化時間為60min。

圖3 比對樣品酶水解條件優(yōu)化

因此，優(yōu)化后的酶解條件為：酶解時間為1 h，DNase I為2Unit，反應(yīng)溫度37℃，Phosphodiesterase I為1.1×10-2Unit，樣品量為400ng。

2.4 酶消解產(chǎn)物的HPLC-IDMS分析及不確定度評定

表3 CCQM P94.2比對樣品HPLC-IDMS定量結(jié)果

利用優(yōu)化后的液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜分離分析條件，對經(jīng)過酶解并定容后的比對樣品進行了定量分析，結(jié)果見表3。測量結(jié)果的不確定度評定主要從方法的精度、樣品和標準溶液的配制稱量、酶消解程度、DNA甲基化效率等方面進行了系統(tǒng)考察，結(jié)果見表4。

表4 DNA甲基化HPLC-IDMS定量結(jié)果各項相對標準不確定度及合成標準不確定度

2.5 DNA甲基化克隆測序結(jié)果及不確定度分析

亞硫酸鹽處理，然后克隆測序測定DNA甲基化含量是DNA甲基化定量測定的金標準；但這種方法操作較為復(fù)雜，且定量結(jié)果的準確度受選取的單克隆數(shù)量的限制。為盡量提高克隆測序的準確度，比對過程中每個樣品隨機選取了200個克隆進行測序，克隆的分辨率提升到0.5%。通過統(tǒng)計計算得到其甲基化含量，評定了其測量結(jié)果的不確定度，結(jié)果見表4。

2.6 比對結(jié)果等效圖

CCQM P94.2國際比對結(jié)果見圖4，圖中實紅線為主導(dǎo)實驗室設(shè)定參考值，兩側(cè)的紅虛線為設(shè)定參考值的不確定度。C-seq為中國計量科學(xué)研究院克隆測序結(jié)果，C-dNMP為中國計量科學(xué)研究院HPLC-IDMS測量結(jié)果?？梢钥闯?，中國計量科學(xué)研究院克隆測序的兩個比對樣品的結(jié)果均與標準值十分吻合。HPLC-IDMS測量結(jié)果均取得了等效度，未知樣2測量結(jié)果與標準值十分吻合。綜合分析表4和圖4可知，克隆測序和HPLC-IDMS測量dNMP含量兩種方法均可較好地完成DNA甲基化定量分析。HPLC-IDMS測量結(jié)果可以通過dNMP標準物質(zhì)實現(xiàn)到國際基本單位的溯源，溯源途徑清晰。而克隆測序結(jié)果的溯源途徑還不十分清晰，相對應(yīng)的計量標準物質(zhì)缺乏，急需加強這方面的科技研究。

圖4 CCQM P94.2國際比對結(jié)果

3 結(jié)束語

通過HPLC-IDMS和序列測定兩種方法對比對樣品進行了DNA甲基化含量定量測量，優(yōu)化了酶消解條件、液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜分析條件，選取了足夠量的克隆進行序列測定分析，充分考慮各可能影響測定準確度的因素，評定了測量結(jié)果的不確定度，取得了較好的比對結(jié)果。比對結(jié)果證明了文中建立的方法準確可靠，可為后續(xù)的DNA甲基化計量標準物質(zhì)的研制及臨床診斷中DNA甲基化的定量分析提供借鑒和參考。

[1]Shi H，Maier S，Nimmrich I，et al.Oligonucleotidebased microarray for DNA methylation analysis:Principles and applications[J].Journal of Cellular Biochemistry，2003，88（1）：138-143.

[2]鄧大君.DNA甲基化和去甲基化的研究現(xiàn)狀及思考[J].遺傳，2014，36（5）：403-410.

[3]張敏，權(quán)力，張霆.DNA甲基化水平定量分析方法研究進展[J].國際遺傳學(xué)雜志，2010，33（1）：29-31.

[4]Volkers N.DNA methylation：what is its role in carcinogenesis[J].Journal of the National Cancer Institute，2000，92（10）：789-790.

[5]Dhingra T，Mittal K，Sarma G S.Analytical techniques for DNA methylation[J].Current Pharmaceutical Analysis，2014，10（1）：71-85.

[6]彭思遠，張潔，田美平，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定生物樣本全基因組DNA甲基化[J].分析化學(xué)，2012，40（8）：1201-1206.

[7]國振，符惠，李秀琴，等.橙汁中苯甲酸含量測定的國際比對APMP.QM-P23[J].色譜，2013，31（12）：1194-1200.

[8]張慧敏，陶功華，楊建平，等.毛細管膠束電動色譜測定基因組DNA甲基化水平[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，44（6）：539-541.

[9]Akman K，Haaf T，Vijg J，et al.Genome-wide quantitative analysis of DNA methylation from bisulfite sequencing data[J].Bioinformatics，2014，30（13）：1933-1934.

[10]Longley B J，Spiegelman V S，Wood G S.Quantitative gene analysis of methylation and expression（Q-GAME）in fresh or fixed cells and tissues[J].Experimental Dermatology，2014，23（5）：304-309.

International com parison CCQM P94.2：quantitative analysis of DNA methylation

GAO Yunhua1，CHEN Hongfei2，SHENG Linghui1，WU Liqing1，WANG Jing1
（1.National Institute of Metrology，Beijing 100029，China；2.Nanjing Institute of Measurement and Technology，Nanjing 210037，China）

Two quantitative methods namely liquid chromatography-isotope dilution mass spectrometry（HPLC-IDMS）and Sanger sequencing method（SS）have been established to analyze and determine the CDKN2A gene methylation in the matrix of genomic DNA.The two methods，applied to the international comparison（CCQM P94.2）on quantitative measurement of DNA methylation carried out by the Consultative Committee for the Amount of Substance（CCQM），has investigated the influence of the DNA methylation efficiency，enzymolysis conditions and chromatographic separation conditions upon the measurement results and evaluated the uncertainty in measurement results.The DNA methylation of two unknown comparison samples measured were respectively U1：64.5%±6.1%and U2：46.7%±8.0%by HPLC-IDMS and U1：respectively 48.9%±1.0%and U2：48.9%±1.1%by the SS method.These figures are very close to the reference values from the leading laboratory，i.e.U1：51%±5.9%and U2：46.9%±4.9%.The established HPLC-IDMS and SS method have laid a solid foundation for China to quantitatively measure the DNA methylation in reference materials.

DNA methylation；isotope dilution mass spectrometry；Sanger sequencing；international comparison

A文章編號：1674-5124（2015）06-0047-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.06.011

2014-11-03；

2015-01-17

國家質(zhì)檢行業(yè)公益專項項目資助（201310008）中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目資助（AKY1311）

高運華（1972-），男，山東定陶縣人，副研究員，主要從事核酸計量及相關(guān)的法制計量工作。