霍永久，劉正旭，金曉君，趙國琦

(1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2. 蘇州天馬集團天吉生物制藥有限公司，江蘇 蘇州 215101)

雞蛋蛋清、蛋白中蛋白質含量高達13% ～15%，富含多種對人體有益的蛋白質。雞蛋蛋清、蛋白所含人體必需氨基酸的種類多，配比平衡性好，是生物利用效率最高的一類蛋白質[1]。雞蛋蛋清、蛋白質的黏度大，熱穩(wěn)定性差，且含有卵類黏蛋白、卵白蛋白、卵轉鐵蛋白和溶菌酶等過敏性蛋白，其應用范圍因此而受到限制[2]。水解可以降低蛋清、蛋白的相對分子質量，減小致敏性，生成的多肽混合物更有利于人體吸收[3–4]，與原蛋白相比，其水解產(chǎn)物的黏度、溶解性及起泡性等功能特性得到了改善，且具有抗氧化、降血脂、降血壓等生理活性[5–6]。單酶水解雞蛋蛋清、蛋白存在水解度不高、蛋白殘留量高、蛋清肽得率低和易產(chǎn)生苦味肽等缺點，因而，研究者嘗試用多酶水解來解決上述問題[7–8]。由于單一蛋白酶水解蛋白質具有專一性，所以，蛋白酶的單一使用使底物中相應的肽鍵斷裂，聯(lián)合使用則因為酶作用位點之間產(chǎn)生互補而降低蛋白殘留量，提高水解度，增加蛋清、蛋白肽得率。筆者研究protamex、neutrase、flavourzyme組合和alcalase、flavourzyme組合水解蛋清、蛋白的水解物的性能，將能降低水解液苦味的端肽酶Flavourzyme作為水解蛋清、蛋白最終加入的酶，以優(yōu)化多酶同時水解及分階段水解的參數(shù)，旨在為蛋清、蛋白多酶水解工藝的優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雞蛋為市售鮮雞蛋。

商業(yè)酶protamex、neutrase 0.8 L、alcalase 2.4 L FG和flavourzyme 500MG購自諾維信公司。

所用試劑為濃硫酸、硫酸銅、無水硫酸鉀、氫氧化鈉、硼酸、鹽酸、甲基紅–溴甲酚綠指示劑、甲醛、30%過氧化氫等。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：HS–4(B)型恒溫浴槽(成都儀器廠)、722 可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)、KDN–04B 消化爐(上海新嘉電子有限公司)、KDN–04B 定氮儀(上海新嘉電子有限公司)、SHA–C水浴恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)、5810R 離心機(德國艾本德(Eppendorf)股份公司)、79–2 磁力加熱攪拌器(常州國華電器有限公司)、PB–21 pH計(德國Sartorius 賽多利斯)、Waters 600 高效液相色譜儀(配備2487 紫外檢測器、Empower 工作站，美國Waters 公司)、Ag1100 安捷倫液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.3 方法

1.3.1 水解前處理

將新鮮雞蛋洗凈，用75%的乙醇棉球擦拭蛋殼，使用漏勺分離蛋清、蛋黃，用滅菌蒸餾水將蛋清稀釋至一定濃度(濃度以V蛋清∶V水表示)，95℃加熱變性20min，用HCl 或NaOH 調節(jié)至一定pH供水解。

1.3.2 水解

在反應溫度條件下水浴預熱后，加入所需酶，于恒溫水浴振蕩器(120 r/min)中進行水解反應。水解反應期間用pH 計監(jiān)測蛋清液的pH，并通過滴加NaOH 溶液來調節(jié)pH，使pH 保持在一定值。于設置的水解時間收集蛋清、蛋白水解液，置沸水浴中滅活酶20min，使水解反應終止。水解方式分為2 種：

1) 將最適溫度和pH 相近的蛋白酶(protamex、neutrase、flavourzyme 3 種酶，下文用“P+N+F”表示)同時加入進行水解，水解溫度設定為55℃，酶總量設定為6%，針對水解時間、pH、酶比例和蛋清濃度4個因素進行正交設計。

2)對于最適溫度和 pH 相差較大的蛋白酶alcalase 和flavourzym(下文用“A–F 表示”)，在alcalase 的最適溫度(55 )℃和最適pH(7.5)條件下反應一定時間后，將反應底物溶液調至flavourzyme 的最適溫度(55 )℃和最適pH(6.0)，再加入flavourzym進行水解。alcalase、flavourzyme 分階段水解蛋清、蛋白的酶總用量設定為6%，針對蛋清濃度、酶比例和水解時間3個因素進行正交試驗。

1.3.3 測定指標及方法

1) 水解度的測定?？偟繙y定采用凱氏定氮法，由凱式半自動定氮儀測得[9]。氨基氮含量測定由甲醛滴定法測得[10]。

水解度=氨基氮含量/總氮含量。

蛋白殘留率=離心沉淀物的含氮量/總氮含量。

2) 蛋清、蛋白水解物相對分子質量的測定。將蛋清、蛋白水解物溶液經(jīng)0.45 μm微孔過濾膜過濾后上TSKgel 2000色譜柱，以細胞色素C(MW12500)、抑肽酶(MW6500)、桿菌酶(MW1450)、乙氨酸–乙氨酸–酪氨酸–精氨酸(MW451)和乙氨酸–乙氨酸–乙氨酸(MW189)為標準品，測定水解物的相對分子質量。

高效液相色譜條件：色譜柱TSKgel 2000，7.8 mm×300 mm；柱溫30℃；流速0.5mL/min；檢測波長220 nm；流動相乙腈、水、三氟乙酸的體積比為45.00∶55.00∶0.01。標準品高效液相色譜圖(相對分子質量流出曲線)和GPC 校正曲線分別見圖1和圖2。

圖1 標準品高效液相色譜圖 Fig.1 High Performance Liquid chromatogram of standard substance

圖2 標準品相對分子質量分布的GPC 校正曲線 Fig.2 GPC calibration curve of molecular weight distribution from standard substance

3) 氨基酸組成分析?？偘被峤M成分析：將蛋清、蛋白水解液樣品溶解在6 mol/L鹽酸中，110℃水解24 h，蒸干鹽酸，定容得水解液。用Agilen 1100高效液相分析儀測定水解液中的氨基酸組成。

高效液相色譜條件：C18柱，4.0 mm×125 mm；柱溫40℃；流速1.0mL/min；檢測波長338 nm和262 nm(Pro)；流動相A為20 mmol/L的醋酸鈉液，流動相B為20 mmol/L的醋酸鈉液和甲醇及乙腈，其體積比為1∶2∶2。

游離氨基酸組成分析：將蛋清、蛋白水解液樣品與10%三氯乙酸溶液等體積混合，在室溫下靜置2 h，經(jīng)雙層濾紙過濾后，取1mL于1.0×104g離心10min。用在線自動衍生化用Agilent 1100高效液相分析儀測定水解液(上清液)中氨基酸組成。

2 結果與分析

2.1 P+N+F 水解雞蛋蛋清、蛋白的試驗結果

2.1.1 正交試驗結果

由表1中的極差分析結果可知，在55℃條件下，水解時間、pH、酶比例、蛋清濃度對水解反應的影響依次減小。3種酶同時水解雞蛋蛋清、蛋白的最優(yōu)組合為A2B2C2D3，即水解時間為6 h、pH為6.5、酶比例為1∶1∶2、蛋清濃度為1∶5。在此條件下的水解度達53.24%。

表1 P+N+F水解蛋清、蛋白的正交試驗結果 Table 1 Orthogonal results of simultaneous hydrolyzing egg white protein using P+N+F

2.1.2 水解產(chǎn)物的相對分子質量分布

由圖3和表2可見，在55℃條件下，當水解時間為6 h、pH為6.5、酶比例為1∶1∶2、蛋清濃度為1∶5時，protamex、neutrase、flavourzyme同時水解水解物的相對分子質量大部分在500以下，即水解物主要以短肽的形式存在，其中相對分子質量為180 ～300和300 ～500的分別為68.06%和18.65%。

圖3 P+N+F 水解蛋清、蛋白產(chǎn)物的高效液相色譜圖 Fig.3 High Performance Liquid chromatogram of enzymolysis product of egg white protein using P+N+F

表2 P+N+F 水解蛋清、蛋白產(chǎn)物的相對分子質量分布 Table 2 Distribution of relative molecular weight from enzymolysis product of egg white protein using P+N+F

2.1.3 產(chǎn)物的總氨基酸組成

由表3可見，在2.1.1最優(yōu)水解條件下，水解物的總游離氨基酸含量為7.404 6mg/mL，占總氨基酸含量的44.02%，即水解產(chǎn)物中有將近50%的成分是以游離氨基酸的形式存在。

表3 P+N+F蛋清、蛋白水解物和水解前蛋清、蛋白的氨基酸組成 Table 3 Amino acid composition of original egg white protein and enzymolysis product of egg white protein using P+N+F

2.2 A–F 水解雞蛋蛋清、蛋白的試驗結果

2.2.1 正交試驗結果

由表6極差分析可知，影響水解反應的主次因素依次為酶比例、蛋清濃度、水解時間，最優(yōu)組合為A3B1C2，即蛋清濃度1∶5，酶比例為1∶2，水解時間各為3 h。在此條件下的水解度可達45.05%。

表4 A–F水解雞蛋蛋清、蛋白的正交試驗結果 Table 4 Orthogonal results of staging enzymolysis of egg white protein using A–F

2.2.2 A–F 水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的相對分子質量分布

A–F水解雞蛋蛋清、蛋白，在蛋清濃度1∶5、酶比例1∶2、水解時間各3 h條件下水解物的相對分子質量分布曲線如圖4所示。

圖4 A–F 水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的高效液相色譜圖 Fig.4 High Performance Liquid chromatogram of staging enzymolysis product of egg white protein using A–F

由表5可知，alcalase、flavourzyme分階段水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的相對分子質量大部分集中在1 000以下，其中≤180、＞180 ～300、＞300 ～500所占的比例分別為11.89%、67.65%、16.05%。

表5 A–F 水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的相對分子質量 Table 5 Distribution of relative molecular weight from enzymolysis product of egg white protein using A–F

2.2.3 A–F 水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的氨基酸組成

在2.2.1的最優(yōu)條件下，A–F水解物的總游離氨基酸含量為6.819 3mg/mL，占總氨基酸含量的38.01%，即水解產(chǎn)物中有近40%的成分是以游離氨基酸的形式存在。

表6 A–F 雞蛋蛋清、蛋白水解物和水解前蛋清、蛋白的氨基酸組成 Table 6 Amino acid composition of original egg white protein and enzymolysis product of egg white protein using A–F

表6 (續(xù))

3 結論與討論

蛋白水解物的苦味主要來自于水解物中的疏水性多肽[11]。如果用于水解的蛋白酶是非專一性的內切酶，那么它們對蛋白原料的酶切作用是隨機的，無論采用何種水解條件都會或多或少產(chǎn)生游離氨基酸，且隨著水解度的提高，蛋白質內部的疏水性氨基酸末端大量游離出來，小肽末端的疏水性氨基酸殘基也逐漸暴露，水解產(chǎn)物的苦味越重。呈苦味的氨基酸主要有亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸。這些疏水性氨基酸殘基在水解液中的比例越高，苦味可能越大?？嚯囊彩堑扒?、蛋白水解物產(chǎn)生苦味的原因之一?？刂苹蛳鞍姿庖嚎辔兜姆椒òㄟx擇性分離法、掩蓋法、類蛋白反應和酶法處理。酶法水解過程易于控制，效率高，且條件溫和，不會使多肽的營養(yǎng)成分丟失，不改變多肽的重要特性。肽鏈端解酶(端肽酶)是酶法處理中主要的酶類。肽鏈內切酶是酶法處理中的另一種酶類，從肽鏈的內部將肽鏈裂開。flavourzyme兼具內外肽酶的活性，將其用于水解不僅能產(chǎn)生端肽酶的外切效應，還能產(chǎn)生美拉德反應，生成濃香的風味物質，使水解液的苦味大大降低。

將flavourzyme和其他蛋白酶聯(lián)合水解不僅能促進蛋白質的溶出，提高氮的回收率[12]，而且可有效水解苦味肽，減輕甚至消除苦味，獲得苦味值低、溶解性好的蛋白水解產(chǎn)物。吳暉等[8]發(fā)現(xiàn)，蛋清水解專用蛋白酶與堿性蛋白酶alcalase AF 2.4 L、堿性蛋白酶alcalase AF 2.4 L與胰蛋白酶組合水解鴨蛋蛋清、蛋白的效果較好，在水解8 h后水解度可達26.2%和26.6%，明顯優(yōu)于其單酶的水解效果。萬麗娜等[10]發(fā)現(xiàn)flavourzyme修飾后的水解液苦味很小，接受度較高。毛善勇等[13]以牛肉為原料，先用protamex在其優(yōu)化條件下水解6 h，再用flavourzyme在其優(yōu)化條件下水解6 h，所得產(chǎn)物的水解度達24.26%，比protamex 單酶水解牛肉蛋白的水解度提高了11.69%。

本試驗中，protamex、neutrase、flavourzyme同時水解雞蛋蛋清、蛋白的水解度達53.24%，比其單獨水解的水解度分別提高了45.84%、49.53%和14.49%；alcalase、flavourzyme分階段水解的水解度達45.05%，比其單獨水解的水解度分別提高了26.32%和6.3%。多酶(分步)水解產(chǎn)物的水解度大幅度增高，主要是因為flavourzyme氨基肽酶的作用，可選擇性從多肽和蛋白質N–端水解釋放氨基酸，使水解液中氨基氮明顯上升[14]。由于不同蛋白酶的作用位點不同，采用多酶復合水解可產(chǎn)生互補效應，能進一步提高水解度和肽的得率。筆者發(fā)現(xiàn)protamex和neutrase單酶水解的水解度低，neutrase單酶水解的蛋白殘留率高，將二者同時與蛋清、蛋白作用能提高水解度，還能改善水解液的風味。alcalase是內切酶，用其水解雞蛋蛋清、蛋白所得的水解液苦味值較大，在alcalase水解一段時間后添加flavourzyme可使苦味值大大降低。Cigic等[12]發(fā)現(xiàn)alcalase和flavourzyme分階段水解有效降低了雞蛋清水解液的苦味，并提高了水解度。

本試驗中，protamex、neutrase、flavourzyme同時水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的相對分子質量分布主要集中在500以下，其中相對分子質量＞180 ～300和＞300 ～500 所占比例分別為68.06%和18.65%。alcalase、flavourzyme分階段水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的相對分子質量主要分布在1 000以下，其中＞180 ～300和＞300 ～500所占的比例分別為67.65%、16.05%?？梢钥闯觯嗝杆獾扒濉⒌鞍桩a(chǎn)物主要以短肽形式存在。短肽有利于人體吸收，致敏性更低，還可提供抗氧化、降血壓、抗菌、降血脂等生物活性，有擴大蛋清應用范圍的潛力[15]。protamex、neutrase、flavourzyme同時水解產(chǎn)物的總游離氨基酸含量為7.404 6mg/mL，占總氨基酸含量的44.02%；alcalase、flavourzyme分階段水解產(chǎn)物的總游離氨基酸含量為6.819 3mg/mL，占總氨基酸含量的38.01%?？梢?，多酶水解產(chǎn)物總氨基酸中，游離氨基酸所占比例較大，在3種酶同時水解的條件下所占比例約達50%。楊萬根等[16]利用單酶alcalase 2.4 L堿性蛋白酶和protease N蛋白酶水解蛋清、蛋白，得到的總游離氨基酸含量分別為6.429、4.193mg/mL。本試驗中多酶水解產(chǎn)物的總游離氨基酸含量與此相比均有明顯提高。另外，protamex、neutrase、flavourzyme 3種酶同時水解物總氨基酸中7種必需氨基酸的含量為43.56%，Alcalase、Flavourzyme分階段水解物總氨基酸中7種必需氨基酸的含量為42.68%，均略高于酶解前蛋清、蛋白中7種必需氨基酸的含量(42.41%)。

通過綜合分析，由本試驗結果可得到如下結論：1) protamex、neutrase和flavourzyme同時水解雞蛋蛋清、蛋白的優(yōu)化條件為水解時間為6 h、pH 6.5、酶比例為1∶1∶2、蛋清濃度為1∶5，在此條件下水解6 h的水解度達53.24%，產(chǎn)物中相對分子質量300以下的比例達68.06%，游離氨基酸比例達44.02%。2) alcalase和flavourzyme分階段水解雞蛋蛋清、蛋白的優(yōu)化條件為蛋清濃度1∶5、酶比例為1∶2、水解時間各3 h，在此條件下的水解度達45.05%。產(chǎn)物相對分子質量大部分集中在500以下，≤180、＞180 ～ 300和＞300 ～500所占的比例分別為11.89%、67.65%、16.05%，游離氨基酸比例達38.01%。

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