張羽，張曉娟，王勝寶，宋曉利，李小剛

(1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 漢中 723000)

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymer- phism，SNP)主要是指由于基因組核苷酸水平上的單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換以及單堿基的插入或缺失變異引起的DNA 序列多態(tài)性，是許多物種基因組中最常見的變異形式，在基因組中的分布頻率很高。SNP在人類[1]、老鼠[2]、擬南芥[3]、大麥[4–5]、大豆[6]、甜瓜[7]、玉米[8]和水稻[9–12]等多個物種中的高密度分布已有報道。作為第3 代分子標(biāo)記的SNP，在基因組中數(shù)量多，分布密度高，特別是由于其不需要根據(jù)片段大小將DNA 分型，因此，可以用高通量基因芯片技術(shù)自動化完成基因分型。目前，檢測SNP 的方法有很多種，但有的需要昂貴的設(shè)備及試劑；有的檢測過程繁瑣，適合于普通實驗室檢測的不多。傳統(tǒng)的nested–PCR(巢式PCR)是一種PCR 改良模式，它由2 輪PCR 擴(kuò)增和2 套引物對組成。首先利用外引物對DNA 進(jìn)行第1 輪擴(kuò)增，然后以第1次PCR 反應(yīng)的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第2 輪擴(kuò)增，第2次PCR 引物與第1次反應(yīng)產(chǎn)物的序列互補(bǔ)，第2次PCR 產(chǎn)物即為目的基因[13–16]。其優(yōu)點在于：如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯誤片斷，那么，第二次能在錯誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的幾率是很低的，因此，巢式PCR 的擴(kuò)增特異性強(qiáng)，且傳統(tǒng)的巢式PCR 需要進(jìn)行2 輪PCR。本研究中利用one tube nested–PCR 方法，把nested–PCR 的4 條引物同時加在1 管PCR 反應(yīng)中進(jìn)行擴(kuò)增，通過引物設(shè)計、引物濃度梯度優(yōu)化及反應(yīng)程序改良，達(dá)到一步快速檢測SNP 基因型的目的。本研究中以1個水稻香味基因Fgr 和3個稻瘟病基因Pi–ta、Pi9、Pigm為例，探索了one tube nested–PCR 技術(shù)的引物設(shè)計原理和反應(yīng)條件，旨在為生物的SNP 基因分型研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

以宜香A 為香稻品種對照材料，黃花占為非香稻品種對照材料。Pi–ta 的抗病對照材料為Tetep，感病對照材料為Nipponbare。Pi9 基因抗病對照材料為WHD75–1–127，感病對照材料為93–11。Pigm基因抗病對照材料為谷梅4，感病對照材料為Nipponbare[17]。以上材料均由陜西省水稻研究所和國家水稻種質(zhì)資源中期庫提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

通過 NCBI 網(wǎng)站(http:www.ncbi.nlm.nih.gov) GenBank 登錄號找出所研究基因的核苷酸序列及Nipponbare 和93–11 中對應(yīng)的染色體序列，編號為AP004463。BAC 克隆得到水稻非香型基因的核苷酸序列，香型基因核苷酸序列來自文獻(xiàn)[18]的報道。GenBank 登錄號為AF207842 和AY196754 的BAC克隆得到編碼稻瘟病基因 Pi–ta 的基因序列；GenBank 登錄號為DQ285630.1 的BAC 克隆得到Pi9 基因序列；GenBank 登錄號為AP005930.3 的BAC 克隆得到Nipponbare 的6 號染色體序列；GenBank 登錄號為AAAA02018909 的BAC 克隆得到93–11 的6 號染色體序列。

同一基因的不同基因型個體進(jìn)行同源序列比對，根據(jù)序列差異設(shè)計引物。在設(shè)計引物時，3′端落在發(fā)生SNP 的位置，由于Taq 酶缺乏3′→5′外切酶的活性，因此，如果3′末端的堿基和模板不互補(bǔ)，特異性擴(kuò)增條帶就會因為延伸速度低于正常末端堿基配對引物的延伸速度而不出現(xiàn)，表明模板DNA與引物3′末端沒有相應(yīng)的突變；反之，則表明模板DNA 上存在與引物3′末端相應(yīng)的突變堿基。如圖1所示，將特異引物(P2 和P3)的3′端落在發(fā)生SNP的位點上，如果設(shè)計P2 的3′端和野生型互補(bǔ)，那么P3 的3′端就設(shè)計成和突變型互補(bǔ)。如圖2 所示，2 條特異性條帶(P1P3 和P2P4)和對照帶(P1P4)都出現(xiàn)的個體為雜合體，只出現(xiàn)1 條特異性條帶和對照帶的為純合體。

圖1 PCR 4 條引物的位置 Fig.1 Relative positions of four primers for PCR

圖2 PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果示意圖 Fig. 2 Schematic of PCR products on electrophoresis

1.2.2 基因組DNA 提取及PCR

用SDS 法提取水稻基因組DNA。用0.8%的瓊脂糖凝膠檢測水稻基因組DNA。

PCR 反應(yīng)體系為：2×Taq MasterMix 15 uL，水稻基因組DNA 1 μL，內(nèi)外引物比5∶1，反應(yīng)總體積30 μL。

反應(yīng)程序為：94.0℃預(yù)變性3.5min，94.0℃變性30 s，4 條引物中Tm最高值增加5℃開始降溫，每個循環(huán)降低1℃，退火1min，72.0℃延伸45 s，15個循環(huán)。94℃變性30 s，Tm最低值降低5℃，退火30 s，72.0℃延伸30 s，20個循環(huán)，最后72.0℃延伸7min。

用2% ～3%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 產(chǎn)物，用BioRad 凝膠成像儀拍照，或用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR 產(chǎn)物，用銀染法顯色拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物信息

用來擴(kuò)增4個結(jié)構(gòu)基因的引物序列如表1 所示。

表1 引物信息 Table 1 Primers information

2.2 發(fā)生SNP 的位置及內(nèi)外引物的位置

圖3、圖4、圖5、圖6 中方框所示為發(fā)生SNP的位置，下劃線處為4 條引物所在位置。從圖3 可以看出，非香稻和香稻基因核苷酸序列同源性比對，發(fā)生了3個SNP(A→T，A→T，C→T)和8個Indel。如果設(shè)計的特異引物序列包含了這11個突變，那么擴(kuò)增特異性將非常強(qiáng)。

圖3 非香稻和香稻Fgr 基因結(jié)構(gòu)部分核苷酸序列的同源性比對結(jié)果 Fig. 3 Results of homology alignment on partial Fgr sequences of fragrant and non-fragrant strains

圖4 為抗病材料和感病材料Pi–ta 基因核苷酸序列的比對結(jié)果。本研究中發(fā)生了1個SNP(G→T)。依照Bryan 等[19]的研究結(jié)果，由于發(fā)生了1個SNP(G→T)，導(dǎo)致抗感基因的編碼產(chǎn)物由抗病產(chǎn)物的丙氨酸(GCT)變異為感病產(chǎn)物的絲氨酸(TCT)。

圖4 抗病材料和感病材料Pi–ta 基因結(jié)構(gòu)部分核苷酸序列的同源性比對結(jié)果 Fig. 4 Results of homology alignment on partial Pi–ta sequences of the resistant and susceptible strains

圖5 為Pi9 基因、粳稻Nipponbare 的6 號染色體與秈稻93–11 的6 號染色體基因序列的同源性比對 結(jié)果。從理論上講，只要含Pi9 基因和不含Pi9基因的材料發(fā)生了SNP 的變化，都可以在發(fā)生SNP處設(shè)計引物加以區(qū)別。

圖5 抗病材料和感病材料Pi9 基因結(jié)構(gòu)部分核苷酸序列的同源性比對結(jié)果 Fig. 5 Results of homology alignment on partial Pi9 sequences of disease-resistant and disease-susceptible strains

Deng Yiwen 等[20]將谷梅4 號的Pigm 定位于水稻第6 染色體上標(biāo)記C5483 和C0428 之間的70 kb區(qū)間內(nèi)，包含5個NBS–LRR 抗性基因，與Pi2、Pi9 緊密連鎖或等位，并在此區(qū)間開發(fā)了檢測Pigm基因的CAPS(酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列)標(biāo)記。筆者將Pigm 基因的CAPS 標(biāo)記轉(zhuǎn)換成SNP 標(biāo)記。圖6 所示為Pigm 基因包含CAPS 標(biāo)記的部分核苷酸序列。

圖6 Pigm 基因標(biāo)記的相對位置及序列 Fig. 6 Relative marker positions and sequence of Pigm

2.3 檢測結(jié)果

如圖7 所示，在水稻的香味基因和非香基因DNA 序列比對中不僅出現(xiàn)了3個SNPs，還有8 bp的InDels，這使得包含此多態(tài)性序列的特異性引物的特異性結(jié)合進(jìn)一步增強(qiáng)，用one tube nested– PCR方法，在野生型和突變型基因型上很容易區(qū)分。香稻材料擴(kuò)增出188 bp 的特異性條帶，非香稻材料擴(kuò)增出279 bp 的特異性條帶，400 bp 左右的條帶為外引物擴(kuò)增的共有帶。

圖7 one tube nested–PCR 檢測Fgr 基因結(jié)果 Fig. 7 The detection results of Fgrgene with one tube nested–PCR

稻瘟病抗性基因Pi–ta 的抗病材料擴(kuò)增出286 bp 的特異條帶，感病材料擴(kuò)增出161 bp 的特異條帶(圖8)。

圖8 One tube nested–PCR 檢測Pi–ta 基因結(jié)果 Fig. 8 The detection results of Pi–tagene with one tube nested–PCR

Pi9 基因的分子標(biāo)記有PB8[21–22]和PB9–1[23]。PB8 標(biāo)記是顯性標(biāo)記，不能區(qū)分個體的基因型是雜合體還是純合體，只能用在育種的早期世代選擇。PB9–1 標(biāo)記雖然是共顯性標(biāo)記，但含有抗性Pi9 基因的材料和粳稻材料只相差3 bp，和秈稻材料只相差5 bp，用瓊脂糖凝膠區(qū)分不了，而聚丙烯酰胺凝膠只有在膠濃度大、膠薄、電泳時間長的實驗條件下才能區(qū)別開來[24]。本研究中根據(jù)Pi9 基因序列和感病對照材料Nipponbare、93–11 進(jìn)行同源性比較的結(jié)果和不同水稻基因型的SNP 開發(fā)出了與Pi9 基因緊密連鎖的共顯性標(biāo)記，抗病材料擴(kuò)增出341 bp的特異條帶，感病材料擴(kuò)增出219 bp 的特異條帶，外引物擴(kuò)增出521 bp 左右的條帶(圖9 所示)。

圖9 one tube nested–PCR 檢測Pi9 和Pigm 的結(jié)果 Fig.9 Detection results of Pi9 and Pigmgene with one tube nested–PCR

基于目前公共數(shù)據(jù)庫中還沒有Pigm 基因序列，而CAPS 標(biāo)記就是因為在酶切識別序列內(nèi)發(fā)生了SNP，根據(jù)PCR 擴(kuò)增后酶切判斷基因型，如果酶切 不完全會造成基因型誤讀，另外有的酶價格十分昂貴，故本研究中將Deng Yiwen 等[20]報道的檢測Pigm 基因的CAPS 標(biāo)記轉(zhuǎn)換成SNP 標(biāo)記。經(jīng)研究，Pigm 基因感病純合體的一段序列為GAATTC，這正好是EcoRI 的酶切識別位點，而其抗病純合體的此段序列突變?yōu)锳AATTC(G→A)。本研究中根據(jù)發(fā)生的這個SNP，設(shè)計了4 條引物進(jìn)行Pigm 基因的檢測?？共〔牧蠑U(kuò)增出150 bp 的特異帶，感病材料擴(kuò)增出200 bp 的特異帶，外引物擴(kuò)增出310 bp 左右的帶(圖9)。

3 利用開發(fā)的基因標(biāo)記鑒定資源的結(jié)果

在構(gòu)建引物時，發(fā)生SNP 的位置決定了2 條內(nèi)引物(特異引物)的位置，1 條內(nèi)引物的3′末端設(shè)計成和野生型基因的序列完全互補(bǔ)，另1 條內(nèi)引物的3′末端設(shè)計成和突變型匹配。外引物的位置調(diào)整遵循以下的原則：首先，保證2 條特異性條帶大小容易在瓊脂糖凝膠上區(qū)分(至少把2 條特異性條帶大小差異控制在50 bp 以上)；其次，外引物擴(kuò)增的條帶不能太大，雖然外引物條帶不影響基因型的判讀，由于和傳統(tǒng)PCR 技術(shù)及nested–PCR 技術(shù)不同，在本研究中，當(dāng)目的片段大小在400 bp 以上時難以擴(kuò)增出產(chǎn)物，從Pi–ta 和Pi9 基因的目的片段大小及擴(kuò)增結(jié)果得到驗證(圖8、圖9、圖10)，借鑒前面的經(jīng)驗，在設(shè)計Pigm 的4 條引物的時候，把Pigm 的目的片段控制在400 bp 以內(nèi)，所有的目的片段都得到了很好的擴(kuò)增(圖11)。圖10 和圖11 為檢測陜西省2013年水稻區(qū)域試驗結(jié)果的隨機(jī)抽取，由于試驗材料大部分為F1，因此基因型大多數(shù)為雜合體。

圖10 利用開發(fā)的Pi9 基因標(biāo)記鑒定資源結(jié)果 Fig.10 Detection resource results via developed Pi9genetic markers

圖11 利用開發(fā)的Pigm 基因標(biāo)記鑒定資源結(jié)果 Fig.11 Detection resource results via developed Pigmgenetic markers

4 討論

傳統(tǒng)的三引物法檢測SNP 需要對同一個樣品進(jìn)行2次PCR，而one tube nested–PCR 技術(shù)，通過一管PCR 擴(kuò)增，即可判讀材料的基因型。one tube nested–PCR 技術(shù)由于是在1個PCR 反應(yīng)中同時加入4 條引物，反應(yīng)中不僅涉及引物與模板間的競爭，同時還涉及引物之間的競爭，因此它比常規(guī)的nested–PCR 技術(shù)要難，關(guān)鍵是多個靶點擴(kuò)增條件往往不兼容，特別是退火溫度，克服4 條引物的退火溫度不一致的情況，可以采用以下方式增加PCR 擴(kuò)增的特異性：1) 復(fù)性溫度采用變溫的方式，先高溫復(fù)性后低溫復(fù)性以及先低溫后高溫復(fù)性的方式進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；2) 采用傳統(tǒng)的touch–down PCR 的方法，從4 條引物中的最高Tm值每個循環(huán)降低1℃至最低Tm值；3) 改良touch–down PCR 的方法，在4條引物中最高溫度的1 條Tm值增加5℃開始降溫，每個循環(huán)降低1℃，運行15個循環(huán)，然后再在4條引物中最低1 條的Tm值降低5℃，運行20個循環(huán)。另外，不同引物的濃度也會影響反應(yīng)結(jié)果，首先，4 條引物按相同濃度添加，然后通過增加“弱”條帶的引物濃度和減少“強(qiáng)”條帶的引物濃度來使3條帶擴(kuò)增強(qiáng)度一致。

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