吳滟輝，王曉君

(1.湖南農業(yè)大學附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410128，2.湖南農業(yè)大學分析測試中心，湖南 長沙 410128)

致乏蚊蟲[1–2]是尖音庫蚊的一個亞種，在中國廣泛分布于上海、江蘇、安徽、河南、陜西、西藏等地區(qū)，其幼蟲在臟污的水中生長，發(fā)育成蛹、蚊。雄蚊吸食花粉、花蜜和植物汁液；雌蚊叮咬人畜，吸食血液，并傳播班氏絲蟲病、流行性乙型腦炎等疫病，至于能否傳播其他疾病，目前尚缺少這方面的研究。為了準確評估致乏蚊蟲的公共衛(wèi)生意義，筆者利用PCR–DGGE技術對致乏庫蚊雌成蟲的帶菌情況進行了分析，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

致乏庫蚊采自湖南農業(yè)大學校園(經形態(tài)學和分子生物學鑒定認定為致乏庫蚊)。標本保存于湖南農業(yè)大學寄生蟲教研室。

1.2 主要試劑與儀器

2×EasyTaq PCR SuperMix、2×TransTaq HiFi SuperMix Ⅰ為北京全式金生物技術有限公司產品；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA片段快速純化/回收試劑盒為北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產品；高純質粒小提試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產品；EcoRⅠ、XhoⅠ、pMD18–T、E. coli DH5ɑ為寶生物工程(大連)有限公司產品。擴增引物341f(5′–CCTACGGAGGCAGCAG–3′)、907r(5′–CCC CGTCAATTCATTTGAGTTT–3′)、341fGC(5′–CGCC CGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACG GGGGGCCTACGGAGGCAGCAG–3′)和518r(5′–AT TACCGCGGCTGCTGG–3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

主要儀器：變性梯度凝膠電泳儀系統(tǒng)(JY– TD331，北京君意東方電泳設備有限公司產品)； PCR儀(2720 thermal cycler，Applied Biosystems產品)；凝膠成像系統(tǒng)(alphamager?EP，Alpha Innotech產品)。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取

取致乏庫蚊雌成蟲3只，于75%乙醇浸泡90 s；用無菌水沖洗，于無菌條件下研磨；加無菌生理鹽水500.00 μL，200×g離心1min，取上清液。按試劑盒說明書操作，提取細菌基因組DNA。

1.3.2 16S rDNA V3–V5 區(qū)的擴增

以341f和907r為引物擴增16S rDNA V3–V5區(qū)。擴增體系50 μL：基因組DNA 5.00 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2.00 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 25.00 μL，ddH2O 16.00 μL。擴增條件：94℃預變性5min；94℃預變性30 s，61.5℃退火30 s，72℃延伸34 S，32個循環(huán)；72℃延伸7min。產物于2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.3 16S rDNA V3 區(qū)的擴增

以上述擴增產物為模板，以341fGC和518r為引物擴增16S rDNA V3區(qū)。擴增體系50 μL：基因組DNA 1.00 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2.00 μL，2×TransTaq HiFi SuperMix 25.00Ⅰ μL，ddH2O 16.00 μL。擴增條件：94℃預變性5min；94℃預變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸12 s，31個循環(huán)；72℃延伸10min。產物于2%瓊脂糖凝膠電泳。以DNA片段快速純化/回收試劑盒純化。

1.3.4 細菌16S rDNA V3 片段變形梯度凝膠電泳

取純化產物7.00 μL進行DGGE凝膠電泳；電泳條件為60℃、120 V、4 h。EB染色，拍照。

1.3.5 切膠回收、克隆和測序

切取凝膠中清晰、明顯的條帶，ddH2O洗滌3次，搗碎，加入無菌生理鹽水40.00 μL，4℃過夜。12 000×g離心過夜產物5min。

取上清液5 μL，以341f和518r為引物擴增，條件同1.2.3。以DNA片段快速純化/回收試劑盒回收PCR產物。

取回收產物4.00 μL、pMD18–T載體1 μL、Solution 5.00Ⅰ μL，16℃條件下連接12 h。連接產物轉化于E.coli DH5ɑ感受態(tài)細胞；涂布于含X–Gal、IPTG和氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12 h。挑選單個白色菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12 h。

以高純質粒小提試劑盒提取質粒；取質粒7.00 μL, EcoRⅠ、XhoⅠ各1.00 μL，10×H Buffer 2.00 μL，ddH2O 9.00 μL，37℃酶切1 h；產物于2%瓊脂糖凝膠電泳。陽性質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

將所測序列與GenBank登錄序列Blast進行比對，尋找親緣關系最為相近的菌種或序列。用Quantity One4.6.2對DGGE圖譜進行分析。

2 結果與分析

2.1 細菌基因組DNA 的擴增結果

以341f和907r為引物擴增致乏庫蚊雌成蟲細菌基因組DNA的產物大小(圖1–A)與預計大小一致。以341fGC和518r為引物擴增，獲得細菌16S rDNA V3區(qū)產物的大小約為180 bp(圖1–B)，與預計大小相符。

圖1 細菌16S rDNA V3–V5區(qū)(A)和16S rDNA V3 (B)擴增結果 Fig.1 Amplification fragments of the bacteria 16S rDNA V3–V5 region (A) and V3 region (B)

2.2 16S rDNA V3 區(qū)片段的DGGE 電泳結果

對致乏庫蚊成蚊攜帶菌16S rDNA V3區(qū)片段進行DGGE的結果見圖2–A；以Quantity One繪制DGGE示意圖(圖2–B)。

圖2 細菌16S rDNAV3 區(qū)DGGE 指紋 Fig.2 DGGE profiles of the bacteria 16S rDNA V3 region

由圖2可知，DGGE凝膠中較亮的條帶共6條，表明有6 種優(yōu)勢菌。6個條帶內的DNA 序列與GenBank數(shù)據(jù)比對的結果(表1)為：1種為派畢梯斯沃巴契亞體(Wolbachia pipientis)，另外5種分別與假單胞菌屬、埃希氏桿菌屬、沃爾巴克氏體屬和γ–變形綱、α–變形綱未知種的親緣關系極近。

表1 DGGE 條帶序列分析比對結果 Table 1 Analysis and blast result of the DGGE band sequences

3 結論與討論

本研究結果表明，致乏庫蚊攜帶的優(yōu)勢菌共6種，其中1種為派畢梯斯沃巴契亞體(Wolbachia pipientis)，另外5種尚未被鑒定，分別隸屬于假單胞菌屬、埃希氏桿菌屬、沃爾巴克氏體屬和γ–變形綱、α–變形綱某未知種屬。

PCR–DGGE技術[3]已廣泛應用于環(huán)境、食品微生物等諸多領域。2010年，李美等[4]曾利用該技術分析了中華按蚊的中腸菌群結構，并發(fā)現(xiàn)短芽孢桿菌、氣單胞菌、叢毛單胞菌、金黃桿菌以及γ–變形綱的某未知細菌在中華按蚊中腸內存在。本研究結果與前人的研究結果一致。凌天翼[5]從飼養(yǎng)和野生的致乏庫蚊幼蟲體內分離出假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)和埃希氏桿菌屬(Escherichia sp.)10株細菌；Demaio等[6]利用定量培養(yǎng)的方法分析不同狀態(tài)、不同階段的尖音庫蚊Culex pipiens)中腸菌群的變化，認為假單胞菌屬和埃希氏桿菌屬在尖音庫蚊中腸內為優(yōu)勢菌群。Pidiyar等[7]結合傳統(tǒng)分離培養(yǎng)與16SrRNA文庫鑒定野生致乏庫蚊中腸細菌，發(fā)現(xiàn)γ–變形綱的細菌占已分離細菌總數(shù)的70%以上。Hertig等[8]以尖音庫蚊卵巢為研究對象，首次發(fā)現(xiàn)Wolbachia pipientis，之后，Wright等[9]證明該菌也存在于伊蚊屬。本研究DGGE 圖譜中代表Wolbachia 的條帶最亮，表明Wolbachia在致乏庫蚊體內數(shù)量較多，為優(yōu)勢細菌。

環(huán)境中存在大量的細菌[10]。為了減少蚊蟲體表的細菌污染，本試驗中使用了大劑量的75%乙醇和無菌水進行洗滌、稀釋，另外DGGE僅能顯示優(yōu)勢菌群的V3區(qū)條帶，故筆者推測本研究中鑒定的6種細菌可能為致乏庫蚊雌成蚊體內的優(yōu)勢菌群。

[1] 陸寶麟，李蓓思，姬淑紅，等．中國動物志，昆蟲綱，第8卷，雙翅目：蚊科(上卷)[M]．北京：科學出版社，1997．

[2] 陸寶麟，李蓓思，姬淑紅，等．中國動物志，昆蟲綱，第8卷，雙翅目：蚊科(下卷)[M]．北京：科學出版社，1997．

[3] 鮑新宇，楊劍，高新艷，等．DGGE 技術的原理及其在動物胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)研究中的應用[J]．畜牧與飼料科學，2011，32(11)：25–26．

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[5] 凌天翼，唐俊杰．致倦庫蚊幼蟲體內正常菌群的分離和鑒定[J]．貴陽醫(yī)學院學報，1993，18(4)：278–281．

[6] Demaio J，Pumpuni C B，Kent M，et al．The midgut bacterial flora of wild aedes triseriatus，culex pipiens，and psorophora columbiae mosquitoes[J]．Am J Trop Med Hyg，1996，54(2)：219–223．

[7] Pidiyar V J，Jangid K，Patole M S，et al．Studies on cultured and uncultured Microbiota of wild Culex quinquefasciatus mosquito midgut based on 16S ribosomal RNAgene analysis[J]．Am J Trop Med Hyg，2004，70(6)：597–603．

[8] Hertig M，Wolbach S B． Studies on rickettsia-like micro-organisms in insects[J]． The journal of medical research，1924，44(3)：329–374．

[9] Wright J D，Barr A R．The ultrastructure and symbiotic relationships of Wolbachia of mosquitoes of the Aedes scutellarisgroup[J]．Journal of Ultrastructure Research，1980，72(1)：52–64．

[10] 陳東科，孫長貴．實用臨床微生物學檢驗與圖譜[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2011．