才讓吉

(青海省海南州同德縣尕巴松多鎮(zhèn)獸醫(yī)站,青海海南 813299)

ELlSA法檢測?？谔阋呙庖叻墙Y(jié)構(gòu)蛋白抗體的試驗研究

才讓吉

(青海省海南州同德縣尕巴松多鎮(zhèn)獸醫(yī)站,青海海南 813299)

本實驗采用間接ELISA方法檢測?？谔阋卟《?FMDV)常規(guī)疫苗免疫牛的FMD抗體水平。實驗采用引進的10頭大通野血牦牛接種FND滅活疫苗15d 后抗體產(chǎn)生情況,確定了血清抗體產(chǎn)生效價的OD值,實際操作證明該方法簡易、快速、靈敏度高。

FMD;非結(jié)構(gòu)蛋白;ELISA;抗體檢測

口蹄疫病毒（FMDV）的衣殼是20面的對稱體，由VP1、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，除結(jié)構(gòu)蛋白外，F(xiàn)MDV還有幾種非結(jié)構(gòu)蛋白，包括前導蛋白酶2A、2B、2C、3A、3B、3C蛋白酶和3D聚合酶 及它們的前體（兩種以上蛋白的復合體）。

采用疫苗的國家，大多數(shù)動物血清（FMDV）結(jié)構(gòu)蛋白和病毒感染相關(guān)抗原（VIAA既3D）抗體為陽性，因此，一些基于結(jié)構(gòu)蛋白和病毒相關(guān)抗原的診斷方法，很難確定FMDV感染與否，目前的疫苗生產(chǎn)工藝在病毒純化過程中去除了大部分的非結(jié)構(gòu)蛋白，因此用滅活苗免疫動物體內(nèi)的抗體產(chǎn)生，而沒有病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體產(chǎn)生，為此檢測FNDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體的ELISA方法不但可以檢測隱性感染動物，而且以區(qū)分感染動物和免疫動物，并能及時了解免疫動物的抗體水平，有效預防動發(fā)生FDV具有非常重要的意義。

1 使用范圍

FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測ELISAKiT，檢測FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體，不受血清型影響，適用于疫區(qū)凈化檢疫，群體無癥狀評價和口蹄疫疫病的診斷。

2 原理

接種滅活疫苗免疫牛的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（I—ELISA）法用于測定抗體，用抗原將固相載體致敏，加入含有特異抗體的血清，經(jīng)孵育一段時間后，固相載體表面的抗原和抗體形成復合物，洗滌除去其它成分，再加上酶標記的抗抗體，加入底物，在酶的催化作用下與底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)既可進行顯色觀察，現(xiàn)多用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測儀，既酶標儀進行結(jié)果分析。

3 材料與方法

3.1 材料

3.1.1 試劑

3ABC基因表達蛋白包被ELISA板、洗板封閉、陰陽性對照、如果血清中有3ABC抗體與ELISA板上3ABC蛋白結(jié)合，形成抗原—抗體復合物，再與酶標二抗結(jié)合，加入底A、B、終止液。

3.1.2 疫苗

FMD采用?？谔阋邷缁钜呙纾芍袊厣锟萍脊煞萦邢薰旧a(chǎn)的，批號為D10112J。

3.1.3 試驗免疫動物

選用青海省大通縣引進的10頭野血牦牛進行FDV滅活疫苗肌肉注射，每頭注射3ml，在首次免疫15d后采取V采血，制備血清，進行FDN抗體檢測。

3.2 操作程序

（1）（PBST）用無離子水或蒸餾水做1：25倍稀釋

（2）待檢血清樣品和陰陽性對照血清用稀釋液1：21倍稀釋，（120μl血清稀釋液加血清6μl）每孔加入100μl陰陽對照血清樣品平行加兩孔，用封口膜封口，37℃結(jié)合30min。

（3）取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌5次，最后一次拍干。

（4）用血清稀釋液按1：100比例稀釋酶標二抗，每孔加入100μl，用封口膜37℃ 結(jié)合30min。

（5）取掉封口膜，每孔加滿洗滌液洗滌5次，最后一次拍干。

（6）將底物溶液A按1：50比例稀釋于底物溶液B（1ml底物B中加入20μl底物 A）混勻，每孔加入100μl，用封口膜封口，37℃避光作用不超過10min。

（7）每孔加入100μl終止液，注意要按加酶標二抗的順序加入終止液，應(yīng)用酶標儀492nm波長測定吸光值（OD492值）。

4 結(jié)果判定

本試驗檢測了10份接種滅活疫苗15d的牛血清，其NSP—ELISA平均OD492nm值為0.3805，標準差為0.0685，臨界值=0.3805+0.0685×3=0.5860。有8份血清OD492nm值 超出臨界值，表明該I—ELISA對滅活疫苗免疫牛的特異性為96%以上。

5 結(jié)論

從上述計算中可以看到，免疫后15天抗體效價超出臨界值的牛血清有8份，免疫效果理想，抗體效價弱的只有兩頭。滅活疫苗免疫牛血清非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體的檢測結(jié)果表明，本次試驗建立的FMD—3ABC—I—ELISA不但能鑒別免疫動物抗體消長情況，而且對非結(jié)構(gòu)蛋白中的3A、3B、3C對自然感染抗體也具有重大的意義，雖然本次試驗血清份量少，但與上述計算結(jié)果完全吻合。

吸光度報告

圖1 96孔酶標板檢測10份牛免疫血清樣品布局圖

[1] 排合爾丁·穆太力甫，李建玲，馬正海. 烏魯木齊地區(qū)?？谔阋逴型Asia-Ⅰ型雙價滅活疫苗免疫效果的檢測與分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，（27）：9400-9401.