趙國生王 友尤永君韓明寶孫宏飛曹國霞

(1.青島正大有限公司,山東青島 266000; 2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司,天津 300000; 3.河北省寧晉縣畜牧局,河北寧晉 055550)

傳染性支氣管炎病毒活疫苗對H9N2亞型禽流感病毒致病力影響實(shí)驗(yàn)

趙國生1王 友2尤永君2韓明寶2孫宏飛3曹國霞3

(1.青島正大有限公司,山東青島 266000; 2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司,天津 300000; 3.河北省寧晉縣畜牧局,河北寧晉 055550)

自1997年以來，由H9N2禽流感病毒感染造成的家禽業(yè)的重大損失已被大量報道。某肉雞養(yǎng)殖場由H9N2造成的死亡率高達(dá)65%，然而實(shí)驗(yàn)室鑒定分離出的H9N2病毒是低致病性病毒。低致病性流感病毒與其他呼吸道病原體的混合感染，被發(fā)現(xiàn)會導(dǎo)致非常高的死亡率。近年來流行的造成商品肉雞高死淘率的支氣管堵塞，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)與傳染性支氣管炎病毒和H9共感染有很大關(guān)系。傳染性支氣管炎活疫苗被廣泛用于商品肉雞，用來防控雞傳染性支氣管炎。為了探究傳染性支氣管炎活疫苗是否影響低致病性禽流感病毒的致病性，本研究中就傳染性支氣管炎活苗免疫對H9N2亞型禽流感病毒的致病力在SPF雞和SPF雞胚上的影響進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。

1 材料

1.1 生物材料

試驗(yàn)研究

1.2 儀器設(shè)備及試劑

負(fù)壓隔離器，雞胚孵化器，振蕩器，96孔V型反應(yīng)板，SPF雞，飼料和飲水，其他化學(xué)試劑皆是國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

2 方法

2.1 SPF雞實(shí)驗(yàn)分組

120只20日齡SPF雞，平均分成3組。第1組每只雞噴霧接種1羽份的IBV活疫苗，第2組每只雞滴鼻接種106.0EID50H9N2病毒，第3組每只雞接種1羽份IBV活疫苗+106.0EID50H9N2病毒。分組及接種情況見表1。

2.2 排毒時間檢測

每天收集所有組雞只的肛門拭子，利用禽流感病毒抗原檢測試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測。試劑盒檢測陽性樣品經(jīng)無菌處理后尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，雞胚在37℃和相對濕度為55%的孵化器內(nèi)孵化48h，然后，收集尿囊液標(biāo)本，進(jìn)行血凝（HA）和與雞抗血清進(jìn)行血凝抑制（HI）檢測禽流感病毒H9N2病毒的存在。

Cite this article as: BI Jian-Ping, LI PING, XU Xi-Xi, WANG Ting, LI Fei. Anti-rheumatoid arthritic effect of volatile components in notopterygium incisum in rats via anti-inflammatory and anti-angiogenic activities [J]. Chin J Nat Med, 2018, 16(12): 926-935.

2.3 SPF雞胚實(shí)驗(yàn)分組

40只10日齡雞胚患者隨機(jī)分為四組，接種0.2毫升的H9N2亞型禽流感病毒（106EID50 /胚）和/或IBLV（一個劑量的疫苗）。對照組的雞胚接種無菌PBS。雞胚在37℃和相對濕度為55%的孵化器內(nèi)孵化48h，觀察雞胚的肉眼病變。雞胚接種分組情況如下表2。

3 結(jié)果

3.1 SPF雞臨床癥狀觀察

接種病毒前，對所有群體的日常監(jiān)測結(jié)果表明，所有的雞臨床表現(xiàn)正常，沒有發(fā)現(xiàn)任何的異常。H9 +IBV活疫苗組：接種兩天后，雞群開始出現(xiàn)精神沉郁，羽毛逆立，呼吸困難，眼眶周組織和鼻竇腫脹，結(jié)膜炎，鼻、眼有分泌物，一直持續(xù)到接種后六天。個別雞只，出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸困難，伸頸張嘴呼吸。分析認(rèn)為極度呼吸困難是造成高死亡率的主要原因。

（1）H9接種組：接種H9亞型禽流感病毒30只雞，其中有2只雞顯示輕微的臨床癥狀，如精神沉郁，鼻和眼有少量分泌物和輕微結(jié)膜炎。

（2）接種IBV活疫苗組未發(fā)現(xiàn)臨床癥狀；陰性對照組未出現(xiàn)臨床癥狀。

（3）混合接種H9亞型禽流感病毒和IBV活疫苗的雞群有10%（3 / 30）的死亡率，死亡開始于接種后48h；而單獨(dú)接種H9病毒或IBV活疫苗組和陰性對照組未見死亡雞只出現(xiàn)。

3.2 剖檢病變觀察

對所有死亡雞只進(jìn)行剖檢后，發(fā)現(xiàn)氣管和肺臟充血、出血，在支氣管深部發(fā)現(xiàn)黃色堵塞物，黃色堵塞物一直延伸到上支氣管（圖1）

表1 SPF雞接種實(shí)驗(yàn)分組

表2 SPF雞胚接種實(shí)驗(yàn)分組

表3 H9排毒持續(xù)時間檢測結(jié)果

圖1 H9+IBV活疫苗組死亡雞中形成氣管分叉管型（箭）延伸到支氣管（A）；經(jīng)過甲醛固定的氣管末端出現(xiàn)黃色堵塞物（B）。

3.3 H9排毒持續(xù)時間

混合接種H9和IBV活疫苗的雞群從接種后2天到11天，都能從肛門拭子中檢測到H9亞型禽流感病毒陽性；單獨(dú)接種禽流感病毒的雞群從接種后3天到9天，從肛門拭子中檢測到H9亞型禽流感病毒陽性；單獨(dú)接種IBV活疫苗組和空白對照組沒有檢測到H9陽性情況。各實(shí)驗(yàn)組H9排毒檢測情況見表3。

3.4 SPF雞胚病變觀察

接種H9和IBV活疫苗組SPF雞胚發(fā)育明顯遲緩，雞胚皮下充血、有點(diǎn)狀出血；其他三組雞胚發(fā)育和剖檢皆無異常。各組雞胚病變情況見圖3。

圖3 各組雞胚病變情況觀察，接種H9+IBV活疫苗組雞胚（b1-b4）比接種H9雞胚組（a）明顯發(fā)育遲緩（A）；接種H9 + IBV活疫苗組雞胚表面充血，皮下組織有多量出血點(diǎn)，而單獨(dú)接種H9或者IBV活疫苗組沒有顯示出任何病變（B）。

4 討論

在我國H9N2亞型禽流感仍是當(dāng)前禽流感流行的主要亞型。1995年唐秀英等從四川省某發(fā)病雞群中分離到一株H9N2毒株，從西昌發(fā)病雞群中分離到了2株H9N2毒株。此后又從我國部分地區(qū)的發(fā)病雞群、鴨群和豬群中，分離到16株H9N2病毒。由于H9N2禽流感病毒屬于低致病力病原，單純感染不能引起家禽發(fā)病，在動物疫病防控中往往被忽略，從而使其得以廣泛傳播和長足進(jìn)化，目前在全球范圍內(nèi)的野鳥和家禽中廣泛分布。

然而近年來H9N2禽流感的爆發(fā)頻繁導(dǎo)致肉雞養(yǎng)殖場的高死亡率，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但從發(fā)病雞群中分離出致病病毒，實(shí)驗(yàn)室檢測仍然表現(xiàn)為低致病性。到目前為止，對于在野外和實(shí)驗(yàn)室發(fā)生的由H9引起嚴(yán)重臨床癥狀和高死亡率還沒有明確解釋。我們猜測可能與H9和其他呼吸道病原體混合感染有很大關(guān)系。

本研究的結(jié)果表明，H9+IBV活疫苗混合接種比單純接種H9會造成更嚴(yán)重的臨床癥狀和剖檢變化；混合接種甚至能夠引起感染雞的死亡。商品雞場死亡報告中，提到的一系列死后損傷如氣管阻塞、肺充血、氣管分叉處形成的氣管栓塞，在本實(shí)驗(yàn)病雞剖檢中均被觀察到。氣管深部形成的黃色堵塞物，可能是造成窒息死亡的主要原因。眾所周知，類胰蛋白酶對HA裂解活化是必要的，在病毒的致病性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在本實(shí)驗(yàn)中，IBV活疫苗可能提供相關(guān)的酶，一定程度上增強(qiáng)了H9的致病性。據(jù)報道，一種絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域是由冠狀病毒IBV編碼的，在此情況下類似酶的存在可能增加H9N2亞型禽流感病毒的致病性。普遍認(rèn)為，禽流感臨床癥狀和致死效應(yīng)在細(xì)菌病原體、環(huán)境條件和其他應(yīng)激存在的條件下，會造成更大的損失，本次實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了此種觀點(diǎn)。

H9+IBV活疫苗混合接種SPF雞胚與單純接種H9雞胚相比，在H9排毒時間上有所提前，并且排毒持續(xù)時間也有所延長。這可能是造成兩組雞胚不同病變程度的原因。混合接種組雞胚發(fā)育明顯小于單獨(dú)接種H9組；混合接種組雞胚病變程度明顯嚴(yán)重于單獨(dú)接種H9組。這些病變差異與SPF雞實(shí)驗(yàn)組結(jié)果呈現(xiàn)出了一致性。

總之，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)室條件下ILV活疫苗與H9的混合感染促進(jìn)了H9的傳播、增強(qiáng)其致病性、延長了病毒的排毒期限，同時引起了較高的死亡率。關(guān)于IBV臨床分離毒株對H9N2禽流感病毒致病性的影響以及環(huán)境因素的影響，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究去證實(shí)。

[1] 李樹純，李心海，仲書官，等. H9N2亞型禽流感病毒基因組的遺傳進(jìn)化分析[J].病毒學(xué)報，2012（01）：13

[2] 陳陸，劉守川，趙軍，等.不同H9N2亞型禽流感病毒分離株致病力研究及HA抗原性變異分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，（24）：19.