陳慧斌，孫鈞政，王梅英，石麗榮，林祥志

(1 廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，福建 廈門 361012；2 國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361005；3 福建農(nóng)林大學(xué) 金山學(xué)院，福建 福州 350002)

基于16S rDNA-DGGE技術(shù)的真空包裝鰱魚片腐敗菌群研究

陳慧斌1，2，孫鈞政3，王梅英1，石麗榮1，林祥志2

(1 廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，福建 廈門 361012；2 國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361005；3 福建農(nóng)林大學(xué) 金山學(xué)院，福建 福州 350002)

【目的】 對(duì)真空和非真空包裝不同溫度貯藏的鰱魚片的腐敗菌群進(jìn)行研究，為真空包裝冷藏鰱魚片腐敗菌群及貨架期的確定提供參考?！痉椒ā?應(yīng)用16S rDNA V3區(qū)變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析方法，研究不同溫度(4，10，20 ℃)條件下，真空和非真空包裝鰱魚片的腐敗菌群?！窘Y(jié)果】 鰱魚片貯藏終點(diǎn)的微生物具有多樣性，真空包裝鰱魚片的主要腐敗菌為少食嗜酵母菌(Zymophiluspaucivorans)、假單胞菌屬(Pseudomonas)細(xì)菌、梭狀芽孢桿菌(Clostridiumfrigidicarnis)、乳桿菌(Lactobacillusoligofermentans)；不同溫度下假單胞菌屬細(xì)菌、漫游球菌(Vagococcussp.)和莓實(shí)假單胞菌(Pseudomonasfragi)為優(yōu)勢菌；Pseudomonassp.為鰱魚片特征腐敗優(yōu)勢菌。在4 ℃條件下，真空包裝對(duì)一部分細(xì)菌起到抑制作用，鰱魚片腐敗菌群由少食嗜酵母菌、假單胞菌、梭狀芽孢桿菌、威爾氏菌屬(Weissellasp.)和乳桿菌構(gòu)成?！窘Y(jié)論】 16S rDNA-DGGE技術(shù)可以有效揭示真空包裝冷藏鰱魚片腐敗菌群結(jié)構(gòu)。4 ℃冷藏和真空包裝相結(jié)合可改變鰱魚片菌群結(jié)構(gòu)，同時(shí)抑制部分腐敗菌，達(dá)到延長貨架期的目的。

鰱魚片；真空包裝；16SrDNA-DGGE；腐敗菌群

鰱魚是中國的四大養(yǎng)殖淡水魚之一，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，其鮮肉中含蛋白質(zhì)15.3%～18.6%，脂肪1.5%～2%，灰分1.0%～1.4%，無氮浸出物0.2%～1.7%。國內(nèi)外學(xué)者采用殼聚糖涂膜[1]、冷藏和冷凍[2-4]、天然提取物[5-6]、γ-射線輻照[7]、氣調(diào)包裝[8]等方法保鮮鰱魚，取得了較好的效果，但關(guān)于真空包裝對(duì)鰱魚片的保鮮效果尚未見報(bào)道。Fan等[4]認(rèn)為，冷藏和冷凍可以抑制鰱魚片中微生物的生長；胡永金等[8]研究表明，氣調(diào)包裝能有效抑制冷藏鰱魚片需氧菌、嗜冷性細(xì)菌及大腸菌群的生長。以上研究均采用傳統(tǒng)的微生物計(jì)數(shù)方法探討了保鮮方法對(duì)貯藏鰱魚片微生物生長的影響，指出保鮮方法對(duì)鰱魚片菌落數(shù)量具有明顯的抑制作用，但均未對(duì)具體腐敗菌菌株及其被抑制效果進(jìn)行深入分析。

變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)是一種新的微生物檢測方法[9]，國內(nèi)外已有關(guān)于該方法可有效描述食品中的發(fā)酵菌群和腐敗菌群的報(bào)道[10-14]，但目前DGGE技術(shù)在水產(chǎn)品腐敗菌群結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用研究極少，在鰱魚保鮮過程中的腐敗菌分析尚未見報(bào)道。為此，本研究應(yīng)用DGGE技術(shù)，探究真空包裝鰱魚片貯藏終點(diǎn)優(yōu)勢細(xì)菌的分布，以期為更好地研究不同微生物對(duì)真空包裝鰱魚片品質(zhì)的影響奠定基礎(chǔ)，并為冷卻鰱魚片防腐研究和延長貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料 鮮活鰱魚購于福州永輝超市。

1.1.2 主要儀器和試劑 Y-300真空包裝機(jī)，福州勝龍食品包裝機(jī)械設(shè)備有限公司；GSP-9160MBE恒溫培養(yǎng)箱，廈門精藝興業(yè)科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；電泳儀，北京六一儀器廠；PCR儀，BIO-RAD公司；Biorad DCode Apparatus DGGE電泳儀，美國Biorad；GelDoc 2000 System凝膠成像儀，美國Biorad；TakaraTaq酶，寶生物工程有限公司；蛋白酶K，德國Merck公司。

1.2 方 法

1.2.1 鰱魚片處理方法 鮮活鰱魚去內(nèi)臟、鱗片及頭，然后沿脊線剔骨分成兩半，用無菌水洗凈，切分，每份取約200 g用滅菌的真空包裝袋非真空和抽真空包裝，并分別置于4，10和20 ℃下貯藏，每組樣品各3袋。取貯藏感官品質(zhì)敗壞的魚片用于細(xì)菌DNA提取。非真空包裝20 ℃貯藏(A1)和真空包裝20 ℃貯藏(A2)，貯藏腐敗時(shí)間分別為1和2 d；非真空10 ℃貯藏(B1)和真空10 ℃貯藏(B2)，貯藏腐敗時(shí)間分別為10和15 d；非真空4 ℃貯藏(C1)和真空包裝 4 ℃貯藏(C2)，貯藏腐敗時(shí)間分別為20 和30 d；同時(shí)取新鮮鰱魚魚片進(jìn)行微生物培養(yǎng)(F)，收集培養(yǎng)基上的細(xì)菌，用于DNA提取。

1.2.2 細(xì)菌總DNA的提取 貯藏終點(diǎn)時(shí)取5 g魚片剪碎，加入40 mL生理鹽水，振搖15 min后用4層紗布過濾，濾液10 000 r/min離心10 min，沉淀再用無菌雙蒸水洗滌，向沉淀中加入1 mL的TE(Tris-EDTA)和30 μL 50 mg/mL的溶菌酶，37 ℃保溫1 h，然后加入100 μL 100 g/L的SDS和10 μL 20 mg/mL的蛋白酶K，55 ℃保溫1 h。DNA提取參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行，吹干的DNA溶于50 μL TE緩沖液，經(jīng)1%瓊脂糖檢測后，-20 ℃條件下貯藏備用。

1.2.3 PCR反應(yīng) 參考陳慧斌等[15]的方法，采用巢式PCR擴(kuò)增鰱魚片中細(xì)菌菌群的16S rDNA V3區(qū)。第1輪擴(kuò)增16S rDNA，引物對(duì)為8-27f和1492r[15]；第2輪擴(kuò)增V3區(qū)，正向引物為5′端帶40GC夾子的5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，即5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG-GGGCACGGGGGG-3′，反向引物為5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′[15]。本試驗(yàn)所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。第2輪V3區(qū)擴(kuò)增以第1輪16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物為模板。兩輪擴(kuò)增均需做陰性對(duì)照(CK)，用ddH2O代替模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測，并于凝膠成像儀下拍照。

1.2.4 細(xì)菌DGGE分析 鰱魚片中菌群DGGE分析參照Muyzer等[16]的方法并加以改進(jìn)。具體方法為：變性膠用0.8%聚丙烯酰胺凝膠，變性劑梯度為38%～50%(100%變性劑為7 mol/L尿素和400 g/L甲酰胺的混合物)，試驗(yàn)在Biorad DCode DGGE電泳儀上進(jìn)行，使用1×TAE電泳緩沖液，上樣量為15 μL，在150 V電壓和60 ℃ 溫度下電泳6.5 h。電泳結(jié)束后，將DGGE膠片在SYBR GreenⅠ中染色30 min，之后用凝膠成像儀進(jìn)行拍照。

1.2.5 條帶回收及測序 對(duì)DGGE膠上不同遷移距離的單一條帶進(jìn)行回收，最后用50 μL的ddH2O溶解，以此為模板進(jìn)行V3區(qū)PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：模板1.5 μL，10×PCR 緩沖液2.5 μL，Mg2+1.5 μL，dNTP 2 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.2 μL，上、下游引物各0.8 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用 1.5% 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，確認(rèn)條帶后進(jìn)行DNA回收純化，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后送上海生物工程有限公司測序。測序結(jié)果登錄NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST軟件，將所得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌V3區(qū)PCR擴(kuò)增

不同包裝及貯藏條件下腐敗鰱魚片的細(xì)菌總DNA見圖1。

以不同溫度下貯藏終點(diǎn)的鰱魚片的細(xì)菌總 DNA 為模板，采用巢式PCR，先擴(kuò)增16S rDNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，獲得約1 500 bp 的特異性擴(kuò)增條帶(圖2)，所有樣品擴(kuò)增條帶的亮度均較高。以擴(kuò)增獲得的16S rDNA片段為模板，用V3可變區(qū)引物(帶40GC夾子)進(jìn)行16S的V3區(qū)擴(kuò)增，獲得約250 bp的特異性擴(kuò)增片段 (圖3)，所有樣品均有較亮的擴(kuò)增條帶。說明本試驗(yàn)的 PCR 擴(kuò)增條件是合適的，可用于后續(xù)的DGGE電泳分析。

圖1 不同包裝貯藏條件下敗壞鰱魚片細(xì)菌總DNA的電泳結(jié)果M. DNA Marker；A1、A2、B1、B2、C1、C2和F 代表不同包裝貯藏條件下的樣品。下圖同F(xiàn)ig.1 The electrophoresis total microbial DNA extraction from spoiled sliced silver carp at different packing and storage conditionsM. DNA Marker；A1,A2,B1,B2,C1,C2 and F represent the different samples from different packing and storage conditions.The same as the following Fig.

圖2 不同包裝貯藏條件下敗壞鰱魚片細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增片段CK. 陰性對(duì)照 Fig.2 Bacterial 16S rDNA amplify fragment from spoiled sliced silver carp at different packing and storage conditions CK.Negative control

2.2 DGGE圖譜及序列測定

DGGE分析結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，真空包裝和非真空包裝組鰱魚片于不同溫度貯藏至終點(diǎn)時(shí)，條帶存在一定的差異。將不同的條帶進(jìn)行編號(hào)，切割膠回收DNA，PCR擴(kuò)增后，經(jīng)電泳檢測，測序比對(duì)，結(jié)果見表1。由表1可知，除條帶7外，其余條帶與GenBank數(shù)據(jù)庫已知序列相似性均≥99%，條帶7在數(shù)據(jù)庫中與未知菌株GU455092.1的相似度為92%，可能為一新菌株。新鮮鰱魚片進(jìn)行微生物培養(yǎng)后，所獲得的條帶(圖1 F泳道)與其他直接提取微生物條帶存在一定差異。

圖4 不同包裝貯藏條件下敗壞鰱魚片細(xì)菌DNA的DGGE圖譜Fig.4 DGGE profiles of the bacterial community for DNA extracted from spoiled sliced silver carp at different packing and storage conditions

2.3 不同包裝對(duì)菌群的影響

由圖4和表1可知，非真空包裝鰱魚片20 ℃貯藏1 d后，可擴(kuò)增出條帶2，3，8，9，12，13，14，16，18和19，分屬于普羅威斯登菌屬(Providencia)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、少食嗜酵母菌(Zymophiluspaucivorans)、漫游球菌屬(Vagococcussp.)、韋榮球菌屬(Veillonellaceae)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、黃桿菌屬(Flavobacteriaceae)、消化鏈球菌(Peptostreptococcus)等；該溫度下真空包裝貯藏2 d，可擴(kuò)增出條帶3，5，9，10，12，13，14，18和19。真空包裝在10 ℃貯藏15 d，12和19條帶消失，9和10條帶變暗，多出條帶4和20。真空包裝在4 ℃貯藏30 d，條帶5，12，18，19消失，表明真空包裝低溫冷藏對(duì)一部分細(xì)菌起到抑制作用。真空包裝貯藏條件下一直存在的條帶有3，9，10，13和14，其分別為少食嗜酵母菌(Zymophiluspaucivorans)、假單胞菌(Pseudomonassp.)、漫游球菌屬(Vagococcussp.)、乳酸菌(Lactobacillus)。從比對(duì)的結(jié)果可以看出，條帶3，4，9，13和14為4和10 ℃真空包裝貯藏后期的主要優(yōu)勢菌，20 ℃真空包裝除含有與4和10 ℃真空包裝相同的菌以外，還包括條帶10，12和18所代表的菌株。條帶9和13在所有組貯藏終點(diǎn)都有出現(xiàn)，因此這2種菌為鰱魚片貯藏終點(diǎn)的優(yōu)勢菌。條帶3為真空包裝特有的條帶，在貯藏終點(diǎn)該條帶亮度高，說明少食嗜酵母菌(Zymophiluspaucivorans)為真空包裝組的特有優(yōu)勢菌。

表1 不同包裝貯藏條件下敗壞鰱魚片各條帶主要菌種V3區(qū)的比對(duì)結(jié)果Table 1 V3 region blast results for the major bands strains from spoiled sliced silver carp at different packing and storage conditions

注：括號(hào)中的數(shù)據(jù)為最相似菌株V3區(qū)的GenBank登錄號(hào)。

Note:The number in the parentheses was the GenBank accession number for closet relative bacterium V3 region.

2.4 不同溫度貯藏條件下菌群的變化

由圖4和表1可知，在20 ℃貯藏時(shí)，真空和非真空包裝條件下的條帶有2，3，5，8，9，10，12，13，14，16，18和19，其中條帶3，8，9，10，12，13和14較亮，為主要菌群。對(duì)比非真空包裝10與20 ℃條件下貯藏的鰱魚片，其微生物菌群發(fā)生了變化，條帶12(韋榮球菌)、16(黃桿菌)、19(消化鏈球菌)消失或減弱，10 ℃貯藏后出現(xiàn)了條帶7、10，分別為不可培養(yǎng)菌和梭狀芽孢桿菌。4 ℃貯藏的非真空包裝鰱魚片，條帶3，5，10，12，16和19消失，出現(xiàn)條帶1、11和15。不同溫度貯藏及不同包裝的鰱魚片貯藏終點(diǎn)微生物多樣性的變化，說明不同溫度下貯藏鰱魚片的腐敗菌群是不一樣的。不同溫度下貯藏都存在假單胞菌(Pseudomonassp. LB184) 、漫游球菌屬(Vagococcussp.)和莓實(shí)假單胞菌(PseudomonasfragiJCM 5475)。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同溫度和包裝條件下貯藏腐敗鰱魚片的細(xì)菌菌群具有多樣性，低溫貯藏鰱魚片菌群種類相對(duì)于常溫貯藏條帶少，低溫和真空包裝可以改變貯藏鰱魚片的菌群結(jié)構(gòu)。真空包裝條件下，鰱魚片都存在少食嗜酵母菌(Zymophiluspaucivorans)、假單胞菌(Pseudomonassp.)、漫游球菌屬(Vagococcussp.)細(xì)菌和乳酸菌(Lactobacillus)，這些菌為真空包裝鰱魚片的優(yōu)勢菌。江蕓等[17]報(bào)道，在真空包裝條件下豬肉的優(yōu)勢菌為漫游球菌屬(Vagococcussp.)細(xì)菌，本研究只在真空包裝鰱魚片中發(fā)現(xiàn)該菌，說明該菌也是真空包裝魚片的優(yōu)勢菌。

鰱魚片在不同溫度下貯藏都存在假單胞菌(Pseudomonassp.LB184)、漫游球菌屬(Vagococcussp.)細(xì)菌和莓實(shí)假單胞菌(PseudomonasfragiJCM 5475)，表明這些菌為鰱魚片的特定腐敗菌。假單胞菌屬被認(rèn)為是低溫貯藏水產(chǎn)品的優(yōu)勢菌屬[18]，在冷卻豬肉中其也為優(yōu)勢菌屬[10]。Cao等[19]也報(bào)道，牡蠣冷藏時(shí)，溫度越低，假單胞菌屬細(xì)菌所占的比例越大，在冷藏終點(diǎn)時(shí)為優(yōu)勢菌屬。與許振偉等[20]報(bào)道鯉魚有氧冷藏終點(diǎn)的腐敗菌為腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)不同，本試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)這2種腐敗菌，這可能是魚片腐敗菌種類受魚的種類和飼養(yǎng)環(huán)境等影響而存在差異所致。

在4、10和20 ℃下貯藏時(shí)，條帶9都較明亮，且在新鮮鰱魚片中也存在該條帶，說明其所代表的菌屬是鰱魚片的主要菌屬，且在貯藏過程中成為優(yōu)勢菌屬。本研究在4 ℃貯藏的非真空包裝和真空包裝鰱魚片中也都檢出條帶9代表的假單胞菌，且非真空包裝組條帶較為明亮，而在該溫度下真空包裝樣品中Pseudomonassp.UA-G006和PseudomonasfragiJCM 5475條帶基本不存在，說明真空包裝條件下這2種假單胞菌不容易成為優(yōu)勢菌。因此，真空包裝對(duì)假單胞菌的抑制作用與假單胞菌株種類有關(guān)。

本試驗(yàn)中，鰱魚片在4和10 ℃控溫及真空包裝的條件下貯藏，在一定程度上改變了鰱魚片的菌群結(jié)構(gòu)。采用4 ℃真空包裝可以明顯抑制一部分引起鰱魚片腐敗的細(xì)菌，從而延長了鰱魚片的保鮮期。

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Characterization of bacterial flora in vacuum package sliced silver carp based on 16S rDNA-DGGE

CHEN Hui-bin1,2, SUN Jun-zheng3,WANG Mei-ying1,SHI Li-rong1,LIN Xiang-zhi2

(1DepartmentofBiologicalTechnology,XiamenOceanVocationalCollege,Xiamen,Fujian361012,China；2ThirdInstituteofOceanography,StateOceanicAdministration,Xiamen,Fujian361005,China；3JinshanCollege,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

【Objective】 The study explored the spoilage bacteria flora of sliced silver carp under different temperatures,vacuum and air package,in order to provide reference for the study of spoilage bacterial flora and to identify the shelf life of vacuum sliced silver carp.【Method】 16S rDNA-DGGE of V3 region was used to reveal the bacterial flora of vacuum and air package sliced silver carp under different temperatures(4,10,20 ℃) storage.【Result】 DGGE fingerprinting analysis showed that the diversities were observed at the end of storage of sliced silver carp.The spoilage bacterial flora includeZymophiluspaucivorans,Pseudomonassp.,Clostridiumfrigidicarnis,Lactobacillusoligofermentans.Pseudomonassp.,Vagococcussp.,andPseudomonasfragiwere dominant in different temperatures.Pseudomonassp.was the special dominant bacterium in spoilage of sliced silver carp.Vacuum package sliced silver carp stored at 4 ℃ inhibited part of the species of bacteria and the dominant spoilage bacteria wereZymophiluspaucivorans,Pseudomonassp.,Clostridiumfrigidicarnis,Weissellasp.,andLactobacillusoligofermentans.【Conclusion】 16S rDNA-DGGE technology can be used to reveal the spoilage bacterial flora in vacuum package and chilled storage sliced silver carp effectively.Combination of vacuum package and 4 ℃ storage changed the bacterial community and inhibited part of spoilage bacteria,therefore extended the shelf life of vacuum sliced silver carp.

sliced silver carp;vacuum package;16S rDNA-DGGE;spoilage microbial flora

2013-11-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401564)；福建省教育廳科技項(xiàng)目(JA12418)；國家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心開放基金項(xiàng)目(MBRCU201302)

陳慧斌(1981-)，男，福建漳州人，講師，博士，主要從事水產(chǎn)品加工及貯藏研究。E-mail：vipin_chen@163.com

林祥志(1973-)，男，福建莆田人，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事海洋資源綜合利用研究。

時(shí)間:2015-03-12 14:17

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.04.012

TS254.4

A

1671-9387(2015)04-0157-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150312.1417.012.html