婁延岳,杜曉華,羅玉柱，劉 霞,張 磊

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) a 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，b 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2 甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)系，河南 鄭州 451450)

甘南牦牛CYGB基因的克隆及生物信息學(xué)分析

婁延岳1a,2,杜曉華1b,2,羅玉柱2，劉 霞1a,2,張 磊3

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) a 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，b 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2 甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)系，河南 鄭州 451450)

【目的】 探討甘南牦牛CYGB基因的分子結(jié)構(gòu)特征及生理功能?！痉椒ā?提取甘南牦牛血樣基因組DNA，以其為模板PCR分段擴(kuò)增后拼接得到CYGB基因，測(cè)序后進(jìn)行生物信息學(xué)分析?！窘Y(jié)果】 克隆出甘南牦牛CYGB基因，其長(zhǎng)度為8 484 bp，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，外顯子長(zhǎng)度分別為143，232，164和34 bp，內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為5 175，280和2 379 bp，可編碼190個(gè)氨基酸殘基，氨基酸編碼存在明顯的密碼子偏倚現(xiàn)象。與普通牛相比較，甘南牦牛CYGB基因存在73處核苷酸變異位點(diǎn)，其中2處發(fā)生在外顯子2區(qū)域，氨基酸序列未發(fā)生改變；71處發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域。甘南牦牛CYGB擁有“three-over-three”類(lèi)型的螺旋“三明治”折疊結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，甘南牦牛CYGB與黃牛、綿羊等物種之間存在較高的同源性?！窘Y(jié)論】 成功克隆了甘南牦牛CYGB基因，為進(jìn)一步研究牦牛CYGB的遺傳特性和生理機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

甘南牦牛；胞紅蛋白；基因；生物信息學(xué)

胞紅蛋白(Cytoglobin，CYGB)是德國(guó)學(xué)者Burmester等[1]于2002年研究發(fā)現(xiàn)的一種新型攜氧球蛋白，它是繼血紅蛋白、肌紅蛋白和腦紅蛋白后發(fā)現(xiàn)的第4類(lèi)球蛋白，廣泛分布于脊椎動(dòng)物的多種組織和器官[2]。近年來(lái)，因其在機(jī)體缺氧保護(hù)方面的重要作用，CYGB已逐漸成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[3-6]。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)CYGB基因的研究尚處于起步階段，主要涉及人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物[7-9]，對(duì)生活在高寒低氧環(huán)境下的特有畜種牦牛CYGB的研究國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)選取甘肅甘南牦牛類(lèi)群為研究對(duì)象，對(duì)其CYGB基因進(jìn)行克隆測(cè)序[10]，從分子水平研究牦牛CYGB基因的序列結(jié)構(gòu)及相關(guān)生物信息學(xué)特征，以期豐富牦牛攜氧球蛋白基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步探討牦牛CYGB的遺傳特性及相關(guān)生理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 血 樣 從甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存的600份甘南牦?？鼓须S機(jī)抽取2份，用于基因組DNA提取。

1.1.2 主要試劑與儀器 LATaqDNA 聚合酶、pMD18-T載體和DNA快速純化回收試劑盒均購(gòu)自Takara公司；DNA Marker和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司；X-gal和IPTG購(gòu)自Amersco公司；其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。梯度PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 基因組DNA的提取與檢測(cè)

采用PBS-酚/氯仿法提取甘南牦?；蚪MDNA，ddH2O溶解。用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物的設(shè)計(jì)與CYGB基因的分段擴(kuò)增

參照GenBank中普通牛CYGB基因序列(GenBank登錄號(hào)：AC_000176)設(shè)計(jì)4對(duì)引物，交由北京華大公司合成，引物序列和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如表1所示。PCR反應(yīng)的總體積為25 μL，其中含：各引物10 μmol，LATaqDNA聚合酶 2.5 U，dNTP Mixture各0.8 mmol/L，LATaqBuffer Ⅱ(含5 mmol/L Mg2+)，模板100 ng/μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，退火30 s (引物P1、P2、P3、P4退火溫度分別為：59，60，56 和57 ℃)，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences and sizes of amplified products

注：引物位置參考序列為普通牛CYGB基因(GenBank登錄號(hào)：AC_000176)。

Note:Reference sequence of primer position isBostaurusCYGBgene (GenBank accession number:AC_000176).

1.4 CYGB基因的分段克隆

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收目的片段，與 pMD18-T克隆載體在4 ℃條件下過(guò)夜連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至50 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后加900 μL LB培養(yǎng)液搖勻復(fù)蘇1 h。將復(fù)蘇后的菌液涂布于含0.1 mg/mL 氨芐青霉素(Amp)、0.5% IPTG及0.04 mg/mL X-gal的LB平板培養(yǎng)皿表面，37 ℃避光培養(yǎng)12 h ；挑取白色陽(yáng)性單克隆菌落，用LB(Amp+)培養(yǎng)液37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)，之后進(jìn)行菌液PCR 鑒定。PCR反應(yīng)體系為20 μL：菌液1 μL，上、下游引物各0.4 μL，LATaqDNA聚合酶12 μL，水6.2 μL；反應(yīng)程序同1.3節(jié)。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用Lasergene 7.1軟件包中的EditSeq、SeqMan和GeneQuest對(duì)CYGB基因序列進(jìn)行拼接、校對(duì)和分析；使用Bioedit和Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)、PredictProtein (http://www.predictprotein.org/)、SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)等在線分析軟件對(duì)CYGB的氨基酸序列進(jìn)行分析，利用PyMol軟件修飾并輸出三維結(jié)構(gòu)[11]。利用Lasergene 7.1軟件包中的Megalign軟件[12]及BLASTp程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對(duì)甘南牦牛和黃牛的CYGB基因及其編碼氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并進(jìn)行多序列的比對(duì)和同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CYGB基因的分段擴(kuò)增

對(duì)甘南牦?；蚪M進(jìn)行分段擴(kuò)增，得到4條特異性較高的目的條帶(圖1)，且大小與預(yù)期產(chǎn)物相符?？寺y(cè)序結(jié)果表明，P1-F/P1-R引物的擴(kuò)增產(chǎn)物由3 127個(gè)核苷酸組成，P2-F/P2-R引物的擴(kuò)增產(chǎn)物由1 523個(gè)核苷酸組成，P3-F/P3-R引物的擴(kuò)增產(chǎn)物由2 052個(gè)核苷酸組成，P4-F/P4-R引物的擴(kuò)增產(chǎn)物由2 438個(gè)核苷酸組成。對(duì)4段序列手動(dòng)校對(duì)、拼接，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast搜索，結(jié)果表明擴(kuò)增得到的序列是甘南牦牛CYGB基因，長(zhǎng)度為8 484 bp，其中包含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，外顯子長(zhǎng)度分別為143，232，164和34 bp，內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為5 175，280和2 379 bp，該序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank登錄號(hào)：KF669897)。

圖1 甘南牦牛CYGB基因的分段擴(kuò)增M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL4500；1～4.分別為引物P1-F/P1-R、P2-F/P2-R、P3-F/P3-R、P4-F/P4-R擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Separate amplification of CYGB gene of Gannan yakM.DNA Marker DL4500;1-4.Amplified products of P1-F/P1-R，P2-F/P2-R，P3-F/P3-R，P4-F/P4-R

2.2 甘南牦牛CYGB一級(jí)結(jié)構(gòu)及其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)分析

利用Lasergene 7.1軟件包中的EditSeq和GeneGuest軟件對(duì)甘南牦牛CYGB基因中核苷酸組成及其序列結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析。結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，甘南牦牛CYGB基因序列(剪切掉5′和3′側(cè)翼序列)A+T含量低于G+C含量，且其4個(gè)外顯子區(qū)域(cDNA)的G+C含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于A+T含量(G+C含量為63%，A+T含量為37%)。

表2 甘南牦牛CYGB基因各核苷酸含量Table 2 Content of each nucleotide in Gannan yak %

對(duì)甘南牦牛CYGB基因編碼區(qū)進(jìn)行翻譯，得到一條由190個(gè)氨基酸殘基組成的多肽(表3)。由表3可知，CYGB多肽鏈包含所有的20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，其中天冬氨酸、半胱氨酸、色氨酸數(shù)目最少，為3個(gè)；谷氨酸數(shù)目最多，為22個(gè)，占整個(gè)氨基酸組成的11.58%。在編碼谷氨酸的過(guò)程中，密碼子GAG使用了19次，GAA僅使用了3次，前者的使用頻率是后者的6倍多；而在20個(gè)纈氨酸密碼子中，GUG使用了16次，GAA僅使用1次，存在明顯的密碼子偏倚現(xiàn)象。由表3還可知，甘南牦牛CYGB氨基酸序列中含有29個(gè)堿性氨基酸(Lys、Arg、His)、25個(gè)酸性氨基酸(Asp、Glu)、71個(gè)非極性氨基酸(Ala、Ile、Leu、Phe、Trp、Val)、39個(gè)極性氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr)。

通過(guò)Protparam和Bioedit軟件對(duì)CYGB理化性質(zhì)的分析，結(jié)果(表4)表明，甘南牦牛CYGB的相對(duì)分子質(zhì)量為21 459.6，半衰期為30 h；不穩(wěn)定系數(shù)為48.43(不穩(wěn)定系數(shù)大于40即為不穩(wěn)定性蛋白[13])，由此預(yù)測(cè)甘南牦牛CYGB具有不穩(wěn)定性；總平均親水性為-0.301，說(shuō)明CYGB整體呈現(xiàn)親水性，是可溶性蛋白[14]。推測(cè)該編碼產(chǎn)物在pH 7.0環(huán)境下其電荷量為-1.143，理論等電點(diǎn)為6.618。

表3 甘南牦牛CYGB一級(jí)結(jié)構(gòu)中各氨基酸和密碼子的使用頻率Table 3 Using frequency of amino acids and codons of the primary structure of CYGB gene of Gannan yak

注：密碼子數(shù)據(jù)括號(hào)中的數(shù)字為密碼子的使用次數(shù)

Note:The number in parentheses of codon is usage times.

表4 甘南牦牛CYGB的基本理化性質(zhì)Table 4 Basic physicochemical properties of CYGB gene of Gannan yak

2.3 甘南牦牛與普通牛CYGB基因序列及氨基酸序列比對(duì)

將甘南牦牛與普通牛(GenBank登錄號(hào)：AC_000176)的CYGB基因及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，甘南牦牛CYGB基因存在73處核苷酸變異位點(diǎn)，其中有46處轉(zhuǎn)換、20處顛換、4處插入和3處缺失；73處變異位點(diǎn)有71處發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)，有2處發(fā)生在外顯子2區(qū)，其中外顯子2區(qū)的2處突變都是同義突變，甘南牦牛CYGB氨基酸序列未發(fā)生改變；內(nèi)含子區(qū)域在內(nèi)含子1和內(nèi)含子3中分別存在62處和9處核苷酸變異位點(diǎn)。

2.4 甘南牦牛CYGB二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與分析

利用PredictProtein軟件對(duì)CYGB二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示α-螺旋(Helix)占64.21%，無(wú)規(guī)則卷曲(Coil)占35.79%，無(wú)β-折疊，根據(jù)α-螺旋比例大于45%，同時(shí)β-折疊比例小于5%的可定義為α-類(lèi)蛋白質(zhì)的原則[15]可知，甘南牦牛CYGB屬于全α-類(lèi)蛋白質(zhì)。利用 SWISS-MODEL在線軟件進(jìn)行同源建模，得到CYGB三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。CYGB作為細(xì)胞內(nèi)的單體球蛋白，屬于脊椎動(dòng)物6配位、低螺旋球蛋白中的一種，它擁有“three-over-three”類(lèi)型的螺旋“三明治”折疊結(jié)構(gòu)。

2.5 甘南牦牛與其他物種的CYGB同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將甘南牦牛CYGB氨基酸序列與從GenBank中獲得普通牛(AC_000176)、綿羊(NC_019468)、人(NC_000017)、獼猴(NC_007873)、野豬(NC_010454)、馬(NC_009154)、家鼠(NC_005109)、斑馬魚(yú)(NC_007114)8個(gè)物種的CYGB氨基酸序列進(jìn)行相似性分析，并利用MegAlign軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。氨基酸序列相似性分析結(jié)果(表5)表明，甘南牦牛與黃牛CYGB同源性高達(dá)100%，與其他哺乳動(dòng)物的同源性也較高(93.2%～98.4%)，甘南牦牛與這些物種在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中距離較近，其親緣關(guān)系較密切；與斑馬魚(yú)同源性較低，為48%，后者在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中處于另外的分支。CYGB系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)與生物進(jìn)化的物種樹(shù)基本一致，說(shuō)明CYGB基因編碼區(qū)在物種間比較保守，而且它們都有非常相近的生物學(xué)功能。

表5 各種動(dòng)物CYGB同源性比較Table 5 Identity and divergence of CYGB genes of different animals

圖2 基于CYGB基因編碼區(qū)構(gòu)建的各物種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of different species based on CYGB gene coding region

3 討 論

目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)牦牛CYGB的研究尚屬空白。本試驗(yàn)利用PCR克隆及核酸測(cè)序技術(shù)獲得甘南牦牛CYGB基因的核苷酸序列，并采用生物信息學(xué)方法分析了甘南牦牛CYGB的結(jié)構(gòu)與特性[16]。結(jié)果表明，在甘南牦牛CYGB多肽鏈的組成中，不同的氨基酸數(shù)目相差較大，而相同的氨基酸傾向于使用一種或幾種特定的同義密碼子，說(shuō)明甘南牦牛CYGB基因編碼氨基酸的過(guò)程中存在明顯的密碼子偏倚現(xiàn)象[17]。饒友生等[18]研究認(rèn)為，密碼子選擇由可供使用的tRNA的豐度所決定。通過(guò)對(duì)牦牛密碼子使用偏性的研究，利用其偏性特點(diǎn)，可以篩選出牦牛CYGB基因的最優(yōu)密碼子，有針對(duì)性地設(shè)計(jì)相應(yīng)的基因表達(dá)載體，提高CYGB基因的表達(dá)量。

高原低氧適應(yīng)性研究一直備受科學(xué)家們的關(guān)注，但其適應(yīng)機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未能找到與高原低氧適應(yīng)直接相關(guān)的基因。對(duì)CYGB基因結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，其與缺氧關(guān)系密切，是缺氧可調(diào)節(jié)型表達(dá)指示器[19]，這為高原低氧適應(yīng)性的研究提供了新的思路。CYGB在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布廣泛，其中海馬、丘腦和下丘腦表達(dá)量較高，這3個(gè)區(qū)域能迅即感應(yīng)缺氧應(yīng)激，表明CYGB可能在缺氧損傷中起到重要作用[20-21]。這些研究為探討CYGB與高原低氧適應(yīng)性之間的關(guān)聯(lián)提供了有價(jià)值的理論依據(jù)。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)甘南牦牛與黃牛CYGB基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)牦牛CYGB基因內(nèi)含子存在4個(gè)堿基的插入和3個(gè)堿基的缺失，這可能與高原低氧環(huán)境下CYGB的表達(dá)調(diào)控具有一定聯(lián)系。

賈浩等[22-23]研究認(rèn)為，蛋白質(zhì)半衰期與其穩(wěn)定性之間存在密切聯(lián)系，一般來(lái)說(shuō)，半衰期長(zhǎng)則蛋白質(zhì)穩(wěn)定性高。本研究結(jié)果顯示，CYGB具有較長(zhǎng)的半衰期，但卻屬于不穩(wěn)定蛋白，這一特性與其生理功能的發(fā)揮是否存在某種聯(lián)系有待更進(jìn)一步的研究和探討。甘南牦牛CYGB二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與分析表明，牦牛CYGB屬于全α-類(lèi)蛋白質(zhì)，呈“three-over-three”類(lèi)型的螺旋三明治折疊結(jié)構(gòu)，這與前人研究結(jié)果[24]基本一致。

利用Megalign軟件對(duì)CYGB編碼產(chǎn)物進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)甘南牦牛與牛、綿羊等物種在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中距離最近，其親緣關(guān)系最為密切。CYGB基因編碼產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與生物進(jìn)化的物種樹(shù)基本一致，這一結(jié)果與動(dòng)物分類(lèi)學(xué)的觀點(diǎn)相一致，也說(shuō)明CYGB基因編碼區(qū)在這些物種間比較保守。

4 結(jié) 論

本研究克隆出8 484 bp的甘南牦牛CYGB基因，其中包含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，外顯子長(zhǎng)度分別為143，232，164和34 bp，內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為5 175，280和2 379 bp。甘南牦牛外顯子存在2處核苷酸變異位點(diǎn)，二者都是同義突變，未導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生改變；內(nèi)含子區(qū)域存在71處核苷酸變異位點(diǎn)。甘南牦牛系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與生物進(jìn)化的物種樹(shù)基本一致，說(shuō)明CYGB基因編碼區(qū)在物種間比較保守。

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Cloning and bioinformatics analysis ofCYGBgene of Gannan yak

LOU Yan-yue1a,2，DU Xiao-hua1b,2，LUO Yu-zhu2，LIU Xia1a,2，ZHANG Lei3

(1 aCollegeofLifeScienceandTechnology,bCollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730070,China;2GansuKeyLaboratoryofHerbivorousAnimalBiotechnology,Lanzhou,Gansu730070,China；3DepartmentofAnimalScience,HenanVocationalCollegeofAgriculture,Zhengzhou,Henan451450,China)

【Objective】 This study aimed to elucidate the structure and physiological function ofCYGBgene. 【Method】 TheCYGBgene of Gannan yak was amplified through PCR using extracted genomic DNA sequence from blood samples as template.Then the gene was sequenced and analyzed by bioinformatics tools.【Result】 The length of cloned Gannan yakCYGBgene was 8 484 bp,including four exons with lengths of 143,232,164 and 34 bp,and three introns with lengths of 5 175,280 and 2 379 bp,respectively.A total of 190 amino acids were encoded and the usage of synonymous codons was biased.Compared with taurine cattle (Bostaurus),there were 73 nucleotide mutations inCYGBgene of Gannan yak,among which 2 occurred in exon region and 71 occurred in intron region.There were no changes in amino acids.Gannan yakCYGBgene had a spiral sandwich like folded structure with the “three-over-three” type.Phylogenetic analysis showed that Gannan yakCYGBgene had a high homology withBostaurus,Ovisariesand other species.【Conclusion】 Gannan yakCYGBgene was successfully cloned and could be used for further study on genetic characteristics and physiological mechanism.

Gannan yak;cytoglobin;gene;bioinformatics

2013-11-23

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1107RJZA148)；甘肅省教育廳研究生導(dǎo)師項(xiàng)目(1102-04)；甘肅省高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(2013)；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(GAU-CX1037，GAU-CX1038)

婁延岳(1986-)，女，河南南陽(yáng)人，在讀碩士，主要從事動(dòng)物遺傳與分子生物學(xué)研究。E-mail：1023498596@qq.com

劉 霞(1975-)，女，甘肅蘭州人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳與分子生物學(xué)研究。 E-mail：liuxia@gsau.edu.cn

時(shí)間:2015-03-12 14:17

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.04.003

S823.85

A

1671-9387(2015)04-0001-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150312.1417.003.html