高曉龍, 王培軍, 邵志紅, 王國(guó)良, 李銘華

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，上海 200065)

?

·基礎(chǔ)研究·

RNA干擾技術(shù)對(duì)HeLa細(xì)胞hTERT基因的抑制作用

高曉龍, 王培軍, 邵志紅, 王國(guó)良, 李銘華

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，上海 200065)

目的 探討RNA干擾對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因的抑制效應(yīng)。方法 化學(xué)合成靶向于hTERT基因的siRNA，用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入宮頸癌細(xì)胞內(nèi)。實(shí)驗(yàn)分組: 轉(zhuǎn)染組siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、陰性對(duì)照組(siRNA-NC)、空白對(duì)照組(Blank)。通過RT-PCR和Western Blot方法分別檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞hTERT mRNA和蛋白水平，MTS法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 siRNA-3 組的端粒酶活性明顯下降，hTERT mRNA表達(dá)水平顯著下降，hTERT蛋白表達(dá)明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯升高，與其他各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 運(yùn)用RNAi干擾技術(shù)，以hTERT基因?yàn)榘悬c(diǎn)的siRNA能特異性抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞hTERT基因，下調(diào)hTERT mRNA及蛋白表達(dá)水平，抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，為宮頸癌的基因治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

宮頸腫瘤； 人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶； Hela細(xì)胞； RNA干擾； 小干擾RNA

RNA干擾(RNA interference， RNAi)將外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后，可引起與該段RNA同源的mRNA產(chǎn)生特異性降解，其相應(yīng)的基因也受到抑制，這種發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(post transcriptional gene silencing， PTGS)現(xiàn)象被稱之為RNA干擾。各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，21～23個(gè)Nt的短dsRNA，即siRNA(short interference RNA， siRNA)，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞組織內(nèi)引起基因封閉作用，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并且比用核酶或反義RNA更有效、更徹底，是一種全新的基因治療手段。研究證明hTERT為端粒酶活性的必需和限速成分，端粒酶的激活與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)[1-4]。本實(shí)驗(yàn)以hTERT基因?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)，設(shè)計(jì)合成siRNA，并通過陽(yáng)離子脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染入宮頸癌Hela細(xì)胞，研究其抑制hTERT基因表達(dá)的效應(yīng)及其對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，為宮頸癌的基因治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細(xì)胞Hela購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；siRNA試劑盒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；端粒酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；hTERT兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；MTS比色法細(xì)胞繁殖KIT購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；Annexin-V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD Pharmingen公司。

1.2 方法

1.2.1 Hela細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌細(xì)胞株Hela，用含100U/ml雙抗，10%胎牛血清的DMEM全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為: 37℃、5% CO2、100%濕度，約2～3d換全培養(yǎng)基一次。選取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 靶向hTERT基因的siRNA的制備 根據(jù)hTERT(Gene Bank編號(hào)NM003219: 2326-2344)的堿基序列按照Ambion公司siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)其序列，經(jīng)Blast Search檢索確認(rèn)與hTERT 基因以外的人類已知基因序列無(wú)同源性。序列如下:

siRNA-1正義鏈5′-CGGUGUACGCCGAGA-CCAATT-3′，反義鏈5′-UUGGUCUCGGUGUACA-CCGGG-3′；siRNA-2正義鏈5′-AUGCGGCCCCU-GUUUCUGGTT-3′，反義鏈5′-GAGCCAGUCUC-ACCUUCAATT-3′；siRNA-3正義鏈5′-CCAGAA-ACAGGGGCCGCAUTT-3′，反義鏈5′-UUGAAG-GUGAGACUGGCUCTG-3′；siRNA-4正義鏈5′-CAUGCGUCGCAAACU-CUUUTT-3′，反義鏈5′-AAAGAGUUUGCGACGCAUGTT-3′；siRNA-NC正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUC-ACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUCG-GAGAATT-3′。

所有序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司利用化學(xué)合成法合成。

1.2.3 轉(zhuǎn)染 根據(jù)LipofectamineTM2000 reagent 說(shuō)明書的實(shí)驗(yàn)步驟，用無(wú)血清培養(yǎng)液將siRNA與LipofectamineTM2000分別稀釋至工作濃度。兩者均勻混合，室溫下作用20min。分別接種入48孔板，包括實(shí)驗(yàn)組siRNA-1, siRNA-2, siRNA-3, siRNA-4,對(duì)照組siRNA-NC，空白對(duì)照組Blank，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，每孔siRNA的終濃度為 50nmol/L。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞計(jì)數(shù) 取上述轉(zhuǎn)染完畢細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后12、24、48、72h計(jì)數(shù)細(xì)胞，并利用熒光顯微鏡觀察HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，并拍照記錄結(jié)果。

1.2.5 MTS法測(cè)定siRNA hTERT對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響 MTS是繼MTT和XTT染料檢測(cè)后的更新?lián)Q代的產(chǎn)品。轉(zhuǎn)染后分別進(jìn)行48h后按照MTS試劑盒操作說(shuō)明，在酶標(biāo)儀上測(cè)波長(zhǎng)492nm的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 AnnexinV-FITC/PI雙染檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后收集處理后的細(xì)胞培養(yǎng)液于流式專用管。采用CELL QUEST分析軟件及DNA CELL CYCLE ANALYSIS軟件分析細(xì)胞凋亡率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果以點(diǎn)狀二維圖(dot plot)表示。

1.2.7 RT-PCR檢測(cè)hTERT基因的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,加胰酶消化離心收集細(xì)胞，采用TRIzol試劑提取各組的總RNA，進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)hTERT mRNA的水平。cDNA的合成嚴(yán)格按Fermentas公司protocol進(jìn)行。以ACTB基因?yàn)閮?nèi)參照，PCR引物序列: hTERT基因上游: 5′-CTACGGCG-ACATGGAGAACAAGC-3′，下游: 5′-CGCAGCCA-TACTCAGGGACAC-3′；內(nèi)參照基因ACTB上游: 5′-CCTGGCACCCAGCACAATGAAG-3′，下游: 5′-GGGGCCGGACTCGTCATACTC-3′。PCR反應(yīng)條件為95℃變性30s，72℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)30次后。于72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外圖像分析儀攝像，并應(yīng)用天能分析軟件對(duì)凝膠圖像進(jìn)行半定量分析，檢測(cè)各組hTERT mRNA RT-PCR產(chǎn)物與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參ACTB mRNA RT-PCR產(chǎn)物的A值，并將AhTERT/AACTB的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.8 蛋白印跡(Western blot)技術(shù)檢測(cè)hTERT蛋白 將兔抗人β-Actin多克隆抗體(工作濃度為1∶5000)，Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(工作濃度為1∶1000)，進(jìn)行蛋白印跡法分析。將轉(zhuǎn)染完畢細(xì)胞培養(yǎng)48h，裂解液提取總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，一抗封閉過夜，洗膜；二抗封閉2h，ECL發(fā)光，進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后置于倒置顯微鏡下觀察: Blank組、siRNA-NC組、LIP組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞輪廓清楚，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞折光性強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)清亮，很少見到顆粒，細(xì)胞核仁清晰。siRNA-3組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，貼壁性差，形狀不規(guī)則，細(xì)胞皺縮，顆粒增多，細(xì)胞周圍碎片增加，見圖1、2。

2.2 通過MTS實(shí)驗(yàn)比較各組對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后按照GENMED-MTS細(xì)胞繁殖定量檢測(cè)試劑說(shuō)明書，在酶標(biāo)儀上測(cè)波長(zhǎng)492nm的D值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，見圖3。

從圖3可見,siRNA-3組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞抑制率與siRNA-1、siRNA-2、siRNA-4、siRNA-NC、Blank組空白對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖明顯減慢，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而siRNA-NC組和Blank組比較，細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化(P>0.05)。

圖1 未轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞光鏡圖(400×)細(xì)胞輪廓清楚，折光性強(qiáng)，細(xì)胞核仁清晰(黑箭頭)Fig.1 Optical microscopic diagraph of untransfected Hela cells(200×): clear cell outline, strong light reflection and clear nucleolus(black arrow)

圖2 轉(zhuǎn)染后48h宮頸癌Hela細(xì)胞光鏡圖(200×)細(xì)胞皺縮，顆粒增多，碎片增多(紅箭頭)Fig.2 Optical microscopic diagraph of HeLa cells transfected for 48h(200×): shrunken cells, increased particles and fragments(red arrow)

2.3 AnnexinV-FITC/PI雙染檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果以點(diǎn)狀二維圖(dot plot)表示，縱坐標(biāo)為PI，橫坐標(biāo)為AnnexinV-FITC。左下象限為AnnexinV(-)PI(-)雙陰性細(xì)胞群，代表正常細(xì)胞群；右下象限為AnnexinV(+)PI(-)單陽(yáng)性細(xì)胞群，代表早期凋亡細(xì)胞群；右上象限為AnnexinV(+)PI(+)雙陽(yáng)性細(xì)胞群，代表晚期凋亡細(xì)胞群或死亡細(xì)胞群。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析結(jié)果以百分比表示，細(xì)胞的凋亡程度通過AnnexinV/PI雙染色進(jìn)行分析。siRNA-3組、Blank組、siRNA-NC組細(xì)胞凋亡率分別為(48.21±4.25)%、(8.64±0.28)%、(8.67±0.40)%，siRNA-3組凋亡率較高，與Blank組和siRNA-NC組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

圖3 MTS檢測(cè)不同組別Hela細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制,siRNA-3組轉(zhuǎn)染后48h后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制(**P<0.01)Fig.3 Inhibition on HeLa cell proliferation in different groups and at different times by MTS: cell growth was inhibited significantly in siRNA-3 group, as compared with other groups (**P<0.01)

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)宮頸癌Hela細(xì)胞各組凋亡率Fig.4 Apoptosis rate of HeLa cells in different groups by flow cytometry右下象限為AnnexinV(+)PI(-)單陽(yáng)性細(xì)胞群，代表早期凋亡細(xì)胞群；右上象限為AnnexinV(+)PI(+)雙陽(yáng)性細(xì)胞群，代表晚期凋亡細(xì)胞群或死亡細(xì)胞群；siRNA-3組與其他各組相比，凋亡率明顯升高(P<0.01)

2.4 RT-PCR法檢測(cè)hTERT mRNA含量

用LipofectamineTM2000介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染入宮頸癌細(xì)胞中，hTERT mRNA在siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、siRNA-NC、Blank組中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.891±0.10、0.728±0.16、0.463±0.14、0.786±0.08，0.987±0.14、0.987±0.13，siRNA-3組與其他5組相比，hTERT mRNA表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。

圖5 RT-PCR檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后各組宮頸癌hela細(xì)胞中hTERT mRNA的相對(duì)表達(dá)Fig.5 RT-PCR detection of hTERT mRNA expression in cervical carcinoma HeLa cells siRNA-3組與對(duì)照組相比，亮度明顯降低(P<0.01)

2.5 Western blot檢測(cè)hTERT蛋白量

用LipofectamineTM2000將siRNA轉(zhuǎn)染入宮頸癌細(xì)胞中，hTERT蛋白在siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、siRNA-NC、Blank中的相對(duì)表達(dá)分別為(85.64±3.28)%、(70.67±3.40)%、(38.64±5.28)%、(88.87±3.39)%、(89.64±4.18)%、(99.67±5.40)%，siRNA-3組hTERT蛋白表達(dá)明顯下降，與其他5組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6)。

圖6 Western Blot檢測(cè)宮頸癌hela細(xì)胞的hTERT蛋白相對(duì)表達(dá)Fig.6 Western blotting detection of hTERT protein expression in cervical carcinoma Hela cells siRNA-3組灰度與其他各組相比，明顯下降(P<0.01)

3 討 論

1989年，在人宮頸癌Hela細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了具有活性的端粒酶，而正常宮頸組織中無(wú)表達(dá)。端粒酶的激活是宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵步驟，在腫瘤細(xì)胞獲得永生中起著重要的作用。宮頸癌組織中hTERT表達(dá)，與端粒酶活性呈明顯正相關(guān)[5-7]。

目前，腫瘤基因治療的三大手段包括: 反義核苷酸技術(shù)、RNAi技術(shù)、核酶技術(shù)。有學(xué)者已成功運(yùn)用反義寡核苷酸和核酶等技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤基因的抑制，在對(duì)人宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)存在Survivin高表達(dá)的293例細(xì)胞均表現(xiàn)出放射抵抗，而通過采用反義核苷酸技術(shù)抑制其細(xì)胞中Survivin表達(dá)，具有腫瘤抑制的效果。用靶向Survivin 3′端CUA110三聯(lián)體的錘頭狀核酶構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩類惡性黑色素瘤細(xì)胞株，分別為JR8和M14，可明顯抑制Survivin基因的表達(dá)，使凋亡率比其母系細(xì)胞顯著提高，并且使原本對(duì)放射線耐受的惡性黑色素瘤細(xì)胞對(duì)γ射線的敏感性明顯提高。Zhang等[9]利用RNAi靶向抑制生存素基因，從而抑制移植瘤生長(zhǎng)并促進(jìn)其調(diào)亡，并通過增加X線放射治療誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡，增強(qiáng)放射治療對(duì)移植瘤的生長(zhǎng)抑制，進(jìn)而提高移植瘤的放射敏感性。Sioud等[8-9]用RNAi沉默環(huán)氧合酶-2基因抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)。Seo等[10]利用RANi技術(shù)沉默caspase-activated DNase基因抑制hela細(xì)胞的生長(zhǎng)。但是運(yùn)用RANi技術(shù)靶向?qū)m頸癌hTERT基因的特異性抑制目前尚缺乏相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)以hTERT為作用靶點(diǎn)，化學(xué)合成靶向于hTERT的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)，通過陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)宮頸癌Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染后端粒酶活性明顯降低。

RNAi技術(shù)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來(lái)的一門新興的基因阻斷技術(shù)，目前，利用RNAi對(duì)肝癌、胃癌、肺癌的治療已取得一定進(jìn)展，成功沉默相關(guān)基因的表達(dá)。本研究以hTERT為作用靶點(diǎn)，按照siRNA序列設(shè)計(jì)原則，化學(xué)合成siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、siRNA-NC小干擾RNA，理論上都有效，都能夠抑制hTERT基因，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)唯獨(dú)siRNA-3組能夠抑制宮頸癌細(xì)胞hTERT基因、蛋白表達(dá)，增加轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果說(shuō)明，siRNA誘導(dǎo)RNAi，特異性降解同源mRNA，針對(duì)靶基因不同位點(diǎn)所設(shè)計(jì)的siRNA在誘導(dǎo)RNAi的作用效力是不同的。但是我們認(rèn)為siRNA-3序列對(duì)hTERT基因表達(dá)起到關(guān)鍵作用，這與Sakaguchi報(bào)道相一致[11。

研究報(bào)道，端粒酶抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖抑制可能與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。端粒酶抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能通過兩條途徑: (1) 端粒酶活性被抑制導(dǎo)致端粒酶延伸障礙，端粒長(zhǎng)度不能維持，通過P53等凋亡調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;(2) 端粒酶活性被抑制,導(dǎo)致一些已經(jīng)處于極短的端粒不能維持功能，細(xì)胞染色體發(fā)生端粒、融合、DNA破壞，引起細(xì)胞凋亡[12-15]。

外源性siRNA引發(fā)RNAi是短時(shí)效應(yīng)，在多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染人工合成的siRNA后，基因抑制的高峰時(shí)間在轉(zhuǎn)染48h后。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、Blank組、NC組，并在轉(zhuǎn)染后48h運(yùn)用MTS法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果顯示,siRNA-3組與siRNA-1、siRNA-2、siRNA-4、Blank組、NC組相比，其細(xì)胞凋亡率增高,生長(zhǎng)增殖受到抑制[16-17]。

綜上所述，RNAi技術(shù)能特異性沉默宮頸癌細(xì)胞hTERT基因，下調(diào)hTERT基因mRNA及蛋白表達(dá)水平，降低端粒酶活性，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，為宮頸癌的基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Tan J, Zhou XH, Zhu H. hTERT-siRNA could potentiate the cytotoxic effect of gemcitabine to pancreatic cancer cells Bxpc-3[J]. Exp Clin Transplant, 2012,10(4): 386-393.

[2] Hase T, Sato M, Yoshida K， et al. Pivotal role of epithelial cell adhesion molecule in the survival of lung cancer cells[J]. Cancer Sci, 2011,102(8): 1493-1500.

[3] 李正東,傅韻,成曉林,等.siRNA抑制Ki-67表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞阿霉素耐藥性的研究[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版,2011,32(3): 11-14,19.

[4] 劉娜,嚴(yán)海東,李雪竹.MCP-1siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)HKC MCP-1基因沉默效應(yīng)的鑒定[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版,2007,28(2): 42-46.

[5] Liu XQ, Huang HZ, Wang JG， et al. Dendrimers-delivered short hairpin RNA targeting hTERT inhibits oral cancer cell growthinvitroandinvivo[J]. Biochem Pharmacol, 2011,82(1): 17-23.

[6] Ge LH, Shao WL, Zhang YD， et al. RNAi targeting of hTERT gene expression induces apoptosis and inhibits the proliferation of lung cancer cells[J]. Oncology Letters, 2011,2(6): 1121-1129.

[7] Zhang WX, Xing LN. RNAi gene therapy of SiHa cells via targeting human TERT induces growth inhibition and enhances radiosensitivity[J]. Int J Oncol, 2013,43(4): 1228-1234.

[8] Wang L, Shi JJ, Zhang HL， et al. Synergistic anticancer effect of RNAi and photothermal therapy mediated by functionalized single-walled carbon nanotubes[J]. Biomaterials, 2013,34(1): 262-274.

[9] Sioud M. Engineering better immunotherapies via RNA interference[J]. Hum Vacc Immunother, 2014,10(11): 3165-3174.

[10] Seo KS, Kim JS, Park JH， et al. PMA synergistically enhances apicularen A-induced cytotoxicity by disru-pting microtubule networks in HeLa cells[J]. BMC Cancer, 2014,14: 36.

[11] Sakaguchi M, Watanabe M, Kinoshita R， et al. Dramatic increase in expression of a transgene by insertion of promoters downstream of the cargo gene[J]. Mol Biotechnol, 2014,56(7): 621-630.

[12] Bilsland AE, Stevenson K, Liu Y， et al. Mathematical model of a telomerase transcriptional regulatory network developed by cell-based screening: analysis of inhibitor effects and telomerase expression mechanisms[J]. Plos Comput Biol, 2014,10(2): e1003582.

[13] Li J, Zhang GY, Liu T， et al. Construction of a novel vector expressing the fusion suicide gene yCDglyTK and hTERT-shRNA and its antitumor effects[J]. Exp Ther Med, 2012,4(3): 442-448.

[14] 王建軍,劉彧,王宏衛(wèi),等.siRNA抑制survivin的表達(dá)誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡的研究[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版,2007,28(2): 14-18.

[15] 修冰,陳敬德,黃濱濱,等.構(gòu)建shRNA慢病毒載體抑制U937細(xì)胞株VEGFR-1基因的表達(dá)[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版,2010,31(1): 12-16.

[16] Xu H, Gong X, Zhang HH， et al. Targeting human telomerase reverse transcriptase by a simple siRNA expression cassette in hepG2 cells[J]. Hepat Mon, 2015,15(3): e24343.

[17] Xie MX, Chen Q, He SY， et al. Silencing of the human TERT gene by RNAi inhibits A549 lung adenocarcinoma cell growth in vitro andinvivo[J]. Oncol Rep, 2011,26(4): 1019-1027.

Effect of RNA interference targeting hTERT gene on cel apoptosisin cervical carcinoma HeLa cells

GAOXiao-long,WANGPei-jun,SHAOZhi-hong,WANGGuo-liang,LIMing-hua

(Dept. of Radiology, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To investigate the effect of RNA interference(RNAi) targeting human telomerase reverse transcriptase(hTERT) gene on cell apoptosis in cervical carcinoma HeLa cells. Methods Short interfering RNAs(siRNAs) targeting hTERT gene were synthesized, and siRNAs were transfected into Hela cells by cationic lipofection. Cervical carcinoma Hela cells were divided into six groups: blank control group, siRNA-NC group(negative group), siRNA-1, siRNA-2, siRNA-3, and siRNA-4 groups(RNA interference groups). The telomerase hTERT mRNA and hTERT protein were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) and Western blot, respectively. The proliferation of the Hela cell was analyzed by MTS and cell apoptosis was examined by flow cytometry. Results The hTERT mRNA of siRNA-1, siRNA-2, siRNA-3, and siRNA-4 groups, siRNA-NC group and blank group were 1.779±0.42,1.408±0.16,0.463±0.14,0.986±0.08,0.987±0.08,1.717±0.08, respectively. Compared to the other groups, the relative expression level of the hTERT mRNA of siRNA-3 group was declined markedly(P<0.01). The relative activities of the hTERT protein of siRNA-1, siRNA-2, siRNA-3, and siRNA-4 groups, siRNA-NC group and blank group were(85.64±3.28)%,(70.67±3.40)%,(38.64±5.28)%,(88.87±3.39)%,(89.64±4.18)%,(99.67±5.40)%, respectively. In comparison with other groups, the expression level of hTERT protein in siRNA-3 group was declined significantly (P<0.01). The apoptosis rate of siRNA-3, siRNA-NC group and blank group were(48.21±4.25)%,(8.67±0.40)%,(8.64±0.28)%, respectively. Compared with other groups, the apoptosis rate of siRNA-3 group was elevated significantly(P<0.01). Conclusion RNAi can specifically silence the hTERT gene of cervical carcinoma Hela cells by down-regulating the expression of hTERT.

cervical carcinoma; human telomerase reverse transcriptase; HeLa cell; small interfering RNA

10.16118/j.1008-0392.2015.03.004

2015-02-10

國(guó)家自然基金(30670611)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(07jc14054)

高曉龍(1978—)，男，主治醫(yī)師，博士研究生.E-mail: gao_xiaolong@#edu.cn

王培軍.E-mail: tjpjwang@sina.com

R 737.3

A

1008-0392(2015)03-0015-06