胡 海， 黃安華， 何 敏， 陳炳官， 戴亞蕾

(1． 同濟大學附屬東方醫(yī)院微創(chuàng)肝膽外科，上海 200120； 2． 同濟大學醫(yī)學院免疫學教研室，上海 200092)

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·基礎研究·

膽囊結石與膽囊黏膜細胞IL-1β成熟分泌的相關性研究

胡 海1， 黃安華1， 何 敏2， 陳炳官1， 戴亞蕾2

(1． 同濟大學附屬東方醫(yī)院微創(chuàng)肝膽外科，上海 200120； 2． 同濟大學醫(yī)學院免疫學教研室，上海 200092)

目的 探討膽囊結石與膽囊組織IL-1表達及其成熟分泌的相關性。方法 收集膽結石膽囊及其膽汁樣本21例，其中膽固醇結石4例、色素結石7例、混合結石10例，采用PCR檢測細菌感染情況，ELISA檢測膽汁中IL-1，蛋白印跡雜交方法檢測IL-1蛋白表達，免疫組化檢測膽囊黏膜IL-1表達，并分析臨床相關性。結果 在排除伴有細菌感染的情況下，結石患者膽汁IL-1含量在1.93～11.80ng/ml，混合結石組膽汁IL-1(4.753±2.651)顯著高于膽固醇結石組(2.640±0.167)和色素結石組(2.762±1.081)(P<0.05)；免疫組化、蛋白印跡雜交檢測表明膽囊黏膜pro-IL-1、IL-1高表達，推測是膽汁IL-1重要來源之一、并示膽結石患者膽囊黏膜有炎癥小體激活。結論 膽結石患者在非細菌感染情況下，膽汁IL-1增加可能與膽囊黏膜細胞炎癥小體的激活密切相關。

膽結石; 白介素-1; 炎癥小體

膽石癥發(fā)病機制復雜。有大量研究顯示膽結石的發(fā)生發(fā)展與膽道感染密切相關[1]。近30年,隨著社會條件的改善、人們生活水平的提高，腸道寄生蟲的感染得到很好的控制，膽石癥的發(fā)病率并沒有降低反而呈逐年上升趨勢，提示膽結石的發(fā)生可能存在非感染因素。前期研究結果顯示，膽結石和膽囊息肉患者的膽囊黏膜巨噬細胞吞噬脂質后形成的泡沫細胞顯著增加[2]，提示巨噬細胞活化在膽結石發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究旨在前期研究基礎上，進一步探討誘導巨噬細胞活化的相關因子IL-1產(chǎn)生與膽石癥發(fā)生的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2014年2月至2014年4月間在同濟大學附屬東方醫(yī)院確診的膽石病并因膽石癥行膽囊切除的標本21例，其中男性10例，女性11例，年齡在 18～83歲(53.0±18.9)歲。收集的標本包括結石、膽汁和部分膽囊黏膜組織。

1.2 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒和PCR擴增細菌16S rDNA鑒定試劑盒購自寶生物工程有限公司，IL-1β檢測試劑盒購自R&D公司，RIPA蛋白裂解液購自碧云天生物技術公司，IL-1β前體抗體購自Santa公司，成熟IL-1β抗體購自Epitomics公司，SABC免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自博士德公司。

1.3 標本采集與處理

膽囊從患者體內取出后，立即收集膽汁于無菌的15ml試管中，經(jīng)14000r/min,離心20min,離心半徑12cm后，取上清液分裝于2ml eppendorf管中，凍存-80℃冰箱，待后續(xù)檢測，而膽汁中沉淀物溶于100l RNase A中，保存-80℃冰箱用于做細菌16S rDNA鑒定。膽結石顆粒收集于50ml試管中，風干后室溫干燥保存用于結石性質鑒定。膽石癥患者的膽囊黏膜層從膽囊內側仔細剝離，迅速浸泡于RIPA蛋白裂解液中，-80℃冰箱保存用于組織蛋白提取。還有一部分膽囊組織經(jīng)生理鹽水反復沖洗，切成約1cm2×1cm2×0.5 cm3大小的組織標本后立即浸入中性甲醛液中固定24h，流水洗滌30min，再經(jīng)75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇脫水，二甲苯透明，隨后浸蠟4h后定向包埋，制備厚度為3～5μm的石蠟組織切片用于組織化學染色。

1.4 膽汁中IL-1β含量測定

1.5 膽汁中細菌16SrDNA鑒定

膽汁細菌感染按細菌基因組DNA試劑盒說明書提取細菌總DNA，DNA經(jīng)電泳鑒定后行PCR擴增細菌16S rRNA保守片段，其上游引物為5′-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3′，下游引物為5′-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC -3′，PCR產(chǎn)物長度因菌種不同各有差異，一般為 500bp左右。PCR反應條件為94℃5min；94℃ 1min，50～55℃ 1 min，72℃1.5min，擴增30個循環(huán)，72℃ 5min。反應產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，每次實驗設有陰性和陽性對照。

1.6 免疫組織化學染色

將石蠟組織切片脫蠟后經(jīng)3% H2O2滅活內源性酶和熱修復抗原后，用5%BSA封閉20min，再滴加一抗4℃濕盒過夜，室溫復溫1h，PBS清洗后滴加生物素偶聯(lián)二抗37℃孵化30min，再加SABC 37℃孵育20min，經(jīng)新鮮配制的DAB顯色液顯色，在鏡下控制顯色時間，最后經(jīng)蘇木精輕度復染胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，風干后在顯微鏡下觀察并照片。

1.7 印跡雜交檢測IL-1β蛋白表達

將浸泡于裂解液RIPA中的膽囊黏膜組織通過勻漿后，離心提取總蛋白，于99℃煮10min，使蛋白變性，取適量樣品，進行SDS-PAGE電泳。轉膜后，用WB封閉液封閉1h，再先后與一抗和二抗孵育，最后滴加顯色液，用生物發(fā)光成像分析儀檢測蛋白條帶。

1.8 統(tǒng)計學處理

各組間差異性用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 臨床特征及結石性質

依據(jù)患者術前B超檢查、術中所見、術后所獲取的結石，按膽結石外表性質，將21例患者結石分為3組，其中膽固醇結石組4例，膽色素結石組7例，混合結石組10例。結石性質與患者性別關系見表1。

表1 按結石性質分組情況

2.2 膽石癥患者伴細菌感染情況

21例膽汁樣本細菌檢測結果顯示，僅1例(編號17)伴細菌感染,見圖1，該患者為男性色素結石，提示本組膽石癥發(fā)生多為非感染因素所致。為探討非細菌感染所致膽石癥與炎癥相關性，該例未納入后續(xù)研究。

圖1 膽結石患者膽汁中細菌16S rDNA鑒定Fig.1 Identification of bacterial 16S rDNA in bile from patients with gallstoneM: DNA Marker；1-21: 樣本編號；P: 陽性對照；N: 陰性對照

表2 結石患者膽汁中IL-1β含量變化

P=0.041，vs.膽固醇結石組

在正常情況下人體組織[3]和小鼠膽囊上皮細胞[4]不表達或極少量表達IL-1β。本實驗在無細菌感染情況下，膽石癥患者膽汁中均檢測到不同濃度IL-1β,見表2，推測其來源可能與膽囊黏膜合成分泌有關。為證實膽囊黏膜上皮細胞參與IL-1β合成分泌，應用免疫組化檢測了20例膽囊組織IL-1β表達，結果顯示所有膽囊上皮細胞均有IL-1β表達，并呈顆粒聚集現(xiàn)象，偏向分布于膽囊上皮細胞頂側,見圖2，提示膽囊上皮細胞內有IL-1β蛋白合成。

圖2 膽結石患者膽囊黏膜上皮細胞IL-1β表達情況(IHC，×400)Fig.2 Expression of IL-1β in mucosal epithelia of gallbladder from patients with gallstone (IHC, ×400)A: 實驗陰性對照；B: 膽囊黏膜上皮細胞陽性結果(箭頭所示)

為進一步證實膽囊黏膜上皮細胞是膽汁中IL-1β重要來源，本實驗應用Western blotting檢測了其中12個樣本的膽囊黏膜IL-1β前體及成熟IL-1β蛋白表達。結果如圖3所示，每個樣本均見IL-1β前體條帶；成熟IL-1β條帶雖不明顯但也隱約可見，這是因為成熟的IL-1β從上皮細胞分泌到細胞外進入膽汁中而組織中能檢到的IL-1β量很少。證實了膽石癥患者膽囊黏膜上皮細胞已被誘導活化、合成分泌IL-1β。

圖3 膽石癥患者膽囊黏膜組織IL-1β前體及IL-1β蛋白表達Fig.3 Expression of pro-IL-1β and IL-1β protein in mucosal epithelia of gallbladder from patients with gallstone其中1,4,5為膽固醇結石；3,7,8,10,11為色素結石；2,6,9,12為混合結石

3 討 論

有關炎癥在膽石癥發(fā)病中的作用研究已有幾十年，但兩者因果關系并不清楚。目前對膽石癥的研究大多集中在肝臟脂質代謝異常方面，忽略了膽囊本身的局部作用。某些情況下，膽汁中膽固醇持續(xù)過飽和但并未形成膽石。可見過飽和膽固醇是形成結石的必要條件但并非充分條件，而膽囊中某種因素則是促成膽石癥的重要原因。早年認為膽道伴細菌或寄生蟲感染是膽結石發(fā)病的主要誘因，但近年隨著生活水平的提高，膽石癥發(fā)病率仍逐年增高，提示可能存在非感染性因素。本文對臨床非細菌感染樣本進行分析，結果促炎因子IL-1β在膽結石患者膽囊上皮細胞中合成顯著增加，提示IL-1β可能是誘發(fā)膽囊炎癥發(fā)生的重要啟動因素。

IL-1β是IL-1家族中一種重要的促炎因子，在免疫應答和炎癥反應中扮演重要角色。IL-1β成熟分泌是炎癥的標志性事件，與很多疾病的發(fā)生密切相關。動脈粥樣硬化早期IL-1β能減少脂質轉運體ABCA1和ABCG1表達，增強胞內脂質存留，從而促進巨噬細胞泡沫化[5-6]，影響脂蛋白代謝和血管壁功能[7]。本課題組前期研究表明，膽固醇結石和膽固醇息肉患者的膽囊黏膜中存在大量泡沫細胞，推測已被誘導活化的巨噬細胞分泌炎癥因子，從而誘發(fā)了炎癥[2]。已知在正常情況下，人體組織[3]和小鼠膽囊上皮細胞[4]不表達或極少量表達IL-1β。本組膽結石患者不但膽囊黏膜中高表達IL-1β，膽汁中亦檢測到IL-1β存在，提示膽結石患者膽囊黏膜已啟動炎癥反應。

已有研究表明，IL-1β成熟分泌依賴于一個多蛋白復合平臺即炎癥小體的激活。目前報道，有4種炎癥小體激活平臺如NPRP1、NLRP3、IPAF和AIM-2。這些炎癥小體能通過識別細菌或病毒的不同結構而被激活。但NLRP3的激活除細菌、病毒外[8]，還能被體內自身產(chǎn)生的“危險信號”激活，這些“危險信號”包括ATP[9]、尿酸鹽[10]、葡萄糖[11]、β淀粉樣蛋白[12]、氧化型低密度脂蛋白[13]等；另外，鋁佐劑[14]、硅石、木棉[15]、膽固醇結晶[16]等晶體分子也能引起NLRP3激活。本實驗推測，膽汁膽固醇相對飽和對膽囊上皮細胞的作用可能是導致炎癥小體活化的重要因素；IL-1β成熟分泌增加并引起膽汁IL-1β上調，提示膽囊黏膜內已有炎癥小體處于激活狀態(tài)。

本實驗結果顯示，非細菌性炎癥反應在膽石癥發(fā)生中起重要作用；IL-1β產(chǎn)生是促進膽囊炎癥反應的關鍵分子，膽囊上皮細胞可能是膽汁IL-1β的重要來源之一。以上結果為進一步揭示膽囊非細菌性炎癥的發(fā)生提供了有力的證據(jù)。

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Associated of IL-1β expression in gallbladder mucosawith cholecystolithiasis

HUHai1,HUANGAn-hua1,HEMin2,CHENBing-guan1,DAIYa-lei2

(1. Dept. of Mini-invasive Surgery, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China;2. Dept. of Immunology, Medical College, Tongji University, Shanghai 200092, China)

Objective To investigate relations between IL-1expression in gallbladder mucosa and cholecystolithiasis. Methods The gallbladder and gallstone samples were collected from 21 patients undergoing cholecystectomy, including 4 cases with cholesterol gallstone, 7 cases with pigment gallstone and 10 cases with combined gallstone. Bacterial infection in the bile samples was detected by PCR. The levels of IL-1in bile samples were measured by ELISA. IL-1expression in the gallbladder mucosa was detected by Western blotting and Immunohistochemistry. Results The levels of IL-1in the bile without bacterial infection were ranging from 1.93 to 11.80ng/ml. The IL-1level in combined gallstone group(4.753±2.651) was significantly higher than that in cholesterol gallstone group(2.640±0.167) and pigment gallstone group(2.762±1.081) (P<0.05). Furthermore, high expression levels of pro-IL-1and IL-1in gallbladder mucosa were detected. Conclusion In the cases without bacterial infection, elevated IL-1in bile with cholecystolithiasis may be associated with inflammsome activation in gallbladder mucosa.

cholecystolithiasis; IL-1; inflammasome

10.16118/j.1008-0392.2015.03.003

2015-04-10

國家教育部博士點基金(20130072110023)；浦東新區(qū)科委創(chuàng)新基金(PKJ2012-Y61)

胡 海(1968—)，男，主任醫(yī)師，博士.E-mail: huhailc@sina.com

戴亞蕾.E-mail: daiyl@#edu.cn

R 575.6

A

1008-0392(2015)03-0010-05